vps34

1、細胞自噬的揭示機制

加州大學聖地亞哥分校的管坤良教授領導的一支研究團隊揭示了調控細胞自噬的一個關鍵分子機制，研究人員發現，AMPK酶，不僅參與了細胞的感測和能量調控，而且在細胞自噬酶作用方面，也扮演了重要角色。細胞自噬是細胞在惡劣條件下確保其生存的基本應激反應。
研究人員發現，AMPK能以不同的方式，調控一種稱為Vps34激酶家族不同的復合物，一些Vps34酶參與了正常細胞的囊泡運輸——細胞中一種重要的分子運輸，還有一些Vps34復合物則參與了細胞自噬。管教授與其同事們發現，AMPK能抑制那些未參與細胞自噬的酶，而激活參與細胞自噬的Vps34酶。

2、PI3K抑制劑Buparlisib (BKM120)要去哪兒買啊？

BKM120 (NVP-BKM120, Buparlisib) 是一種選擇性 PI3K 抑制劑，在無細胞試驗中作用於p110α/β/δ/γ的IC50分別為 52 nM/166 nM/116 nM/262 nM。對 VPS34，mTOR，DNAPK 的作用效果下降，而對 PI4Kβ幾乎沒有活性。

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3、自噬的自噬的研究方法

正常培養的細胞自噬活性很低，不適於觀察，因此，必須對自噬進行人工干預和調節，經報道的工具葯有：
（一）自噬誘導劑
1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內質網應激
2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）
3）Earle's平衡鹽溶液：製造飢餓
4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑
5）Rapamycin：mTOR抑制劑 (最常用)
6）Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑
（二）自噬抑制劑
1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑
2）Bafilomycin A1：質子泵抑制劑
3）Hydroxychloroquine（羥氯喹）
除了選用上述工具葯外，一般還需結合遺傳學技術對自噬相關基因進行干預：包括反義RNA干擾技術（Knockdown）、突變株篩選、外源基因導入等。
（三）自噬檢測方法：
細胞經誘導或抑制後，需對自噬過程進行觀察和檢測，常用的策略和技術有：
1）Western Blot檢測LC3的切割
利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成。自噬形成時，胞漿型LC3會酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟PE結合轉變為（自噬體）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。

2）在熒光顯微鏡下採用GFP-LC3單熒光體系/mRFP-GFP-LC3雙熒光體系等融合蛋白來示蹤自噬形成：
GFP-LC3 單熒光自噬指示體系：
利用LC3在自噬形成過程中發生聚集的原理，開發出GFP-LC3指示技術：無自噬時，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當於一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。但是綠色斑點增多並不一定代表自噬活性增強，也有可能是自噬溶酶體降解途徑受阻，可以通過western blot 檢測游離的GFP、p62來驗證。
另一種方法是利用mRFP-GFP-LC3 。
mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系：
由於分子生物學的發展，現在已經誕生了mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系，用於標記及追蹤LC3以及自噬流的變化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是穩定的熒光表達基團，不受外界影響。由於自噬小體進入第二階段後，與溶酶體進行融合，形成自噬溶酶體。自噬溶酶體由於溶酶體內部的酸性環境，可以導致PH下降，GFP淬滅，因此，GFP的減弱可指示自噬溶酶體形成的順利程度，GFP越少，則從自噬小體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，自噬小體和溶酶體融合被抑制，自噬溶酶體進程受阻。mRFP是一直穩定表達的，因而可以通過GFP與mRFP的亮點比例來評價自噬流進程。

mRFP-GFP-LC3 雙熒光自噬指示體系的出現，把自噬研究帶入了一個新的階段，自噬不再只是指標，而是一種機制，自噬流的順暢與否，對於細胞生理功能的穩定非常關鍵。

3）透射電鏡下觀察自噬體的形成：
自噬經歷了：吞噬泡(phagophore)--自噬小體(autophagosome)--自噬溶酶體(autolysosome)
透射電鏡下吞噬泡(phagophore)的特徵為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬小體(autophagosome)的特徵為：雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(autolysosome)的特徵為：單層膜，胞漿成分已降解。

4、Beclin 1什麼意思?

Beclin-1 is a protein that in humans is encoded by the BECN1 gene.[1][2]

Beclin-1 is also known as autophagy-related gene (Atg) 6. Beclin-1 and its binding partner class III phosphoinositide 3-kinase (PI3K), also named Vps34, are required for the initiation of the formation of the autophagasome in autophagy.
Beclin-1是一種人體內的蛋白，它是又BECN1基因所編碼的。
同樣，也是與自溶相關的基因。Beclin-1和它的結合物，第三類磷酸肌醇3激酶，同樣也叫Vps34，在自我吞噬過程中形成吞噬小體的起始有關。

5、選擇性p110δ抑制劑Idelalisib作用機制是什麼？

CAL-101 (Idelalisib, GS-1101) 是選擇性p110δ抑制劑，在無細胞試驗中IC50為 2.5 nM；對 p110δ 表現出的選擇性是對 p110α/β/γ 的 40 到 300 倍，對p110δ的選擇性是對 C2β，hVPS34，DNA-PK 和 mTOR的400到4000倍。

CAL-101 對p110α, p110β,和p110γ作用效果不大。CAL-101作用於原代嗜鹼細胞特定阻斷FcϵR1 p110δ調節的 CD63表達，EC50 為8 nM。與急性髓性白血病(AML) 和骨髓增生性腫瘤(MPN) 細胞相比，CAL-101 作用於B-cell急性淋巴細胞白血病(B-ALL)和慢性淋巴細胞白血病(CLL) 細胞時顯示更強的活性。CAL-101 作用於SU-DHL-5, KARPAS-422 和CCRF-SB細胞，降低pAktS473, pAktT308, 和下游靶點S6， EC50為0.1到1.0 μM。 [1] CAL-101 作用於CLL細胞，誘導選擇性細胞毒性，不是通過突變狀態或間期細胞遺傳學,主要通過caspase依賴機制。與正常B細胞相比，CAL-101作用於CLL 細胞優先產生細胞毒性，和LY294002相比，作用於其他造血細胞不會產生毒性。CAL-101 作用於T 細胞和天然殺傷細胞 缺乏直接的細胞毒性潛能。CAL-101抑制炎症細胞因子的產生,比如 IL-6, IL-10, TNF-α,和IFN-γ,且激活誘導的細胞因子,如CD40L。CAL-101 也抗CD40L調節的CLL細胞存活。[2] CAL-101 作用於L1236和L591細胞, 誘導細胞在G1期積累，在S期下降，說明 CAL-101可以作為治療霍傑金淋巴瘤(HL)的一種新策略。

參考鏈接：http://www.selleck.cn/procts/CAL-101.html

6、PI3K抑制劑3-MA的配製以及使用說明？

3-Methyladenine是一種選擇性PI3K抑制劑，作用於Vps34和PI3Kγ，IC50分別為25 μM和60 μM；永久抑制I型PI3K，但對III型PI3K的抑制是短暫的，也抑制自噬體的形成。
體內研究：3-Methyladenine (3-MA)可以通過對磷酸肌醇3磷酸激酶(PI3K) 的作用來阻斷自吞噬, 而PI3K的活性對於自噬體形成早期膜池的成核和組裝是必須的。與SAH 處理組相比3-MA並不會改變出血的程度。與SAH +對照成分組相比經過3-MA預處理後會明顯加重神經病學症狀。3-MA處理會減少自吞噬發生。 相反地,在SAH + 3-MA組里 斷裂的半胱天冬酶表達量明顯上調，與此一致的是與SAH + 對照成分組相比，SAH + 3-MA組中右腦皮層里原位末端標記陽性細胞數量明顯增多。