grna靶位点设计网站

1、sgrna是 靶标基因序列 上的一段吗

基因解码，也就是基因检测后的信息解读工作，将是即互联网信息后另一个正在来断被开发的新领域。其应用价值不可估量。佳学基因可以帮助你回答的

2、:要将目的基因最终克隆到表达载体当中,目的基因靠近ATG的末端需要加哪种限制

怎么才能设计出好的sgRNA呢？既要考虑切割效率，也要考虑特异性。

切割效率
靶位点的位置：

1、避免靶向基因的N端或C端：避免靶向基因的N端以减轻细胞使用起始密码子下游的替代ATG。而避免靶向基因的C端以最大化创建非功能等位基因的机会。（因为靠近蛋白末端的片段突变不太可能干扰基因表达）；

2、避免靶向5’和3’ UTRs区；

3、有些基因特异性的模式，如空间位阻等也会降低基因编辑效率。
特异性
截短gRNAs （trugRNAs）
crRNA序列小于20个核苷酸，可以减少脱靶位点突变多达5000倍或更多，而不牺牲靶基因组编辑效率。具有17或18个核苷酸的截短gRNA称为“trugRNA”。
17个核苷酸是实现有效基因编辑的最小长度。
根据经验，还是推荐大家使用18-19bp的trugRNA，有些17bp的trugRNA可能不起作用。（可能的原因是：20bp的gRNA对其靶位点具有比所需更多的亲和力，因此18-19bp的trugRNA也会起作用，而且trugRNA可能使tru-RGN/DNA复合物对错配更敏感。）trugRNA可以有效地在人类细胞中引入靶向插入缺失（indel）或HDR介导的基因组编辑事件。

3、crispr系统中sgrna和grna一样吗

sgrna是single guide RNA（单导向RNA）的缩写。在CRISPR/Cas9系统中sgRNA与gRNA是一个概念。

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是原核生物基因组内的一段重复序列，是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务。

细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR-Cas9系统，利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的基因组上切除，这是细菌特有的免疫系统。

扩展知识：

功能特点：

CRISPR是生物科学领域的游戏规则改变者，这种突破性的技术通过一种名叫Cas9的特殊编程的酶发现、切除并取代DNA的特定部分。这种技术的影响极其深远，从改变老鼠皮毛的颜色到设计不传播疟疾的蚊子和抗虫害作物，再到修正镰状细胞性贫血等各类遗传疾病等等。

该技术具有非常精准、廉价、易于使用，并且非常强大的特点。 

CRISPR来自微生物的免疫系统，这种工程编辑系统利用一种酶，能把一段作为引导工具的小RNA切入DNA，就能在此处切断或做其他改变。以往研究表明，通过这些介入，CRISPR能使基因组更有效地产生变化或突变，效率比TALEN（转录激活因子类感受器核酸酶）等其他基因编辑技术更高。

虽然CRISPR有许多优点，在人类癌细胞系列中，它也可能产生大量“误伤目标”，尤其是对不希望改变的基因做修改。

4、新手指南：如何设计CRISPR实验进行基因组编辑

十年前，当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为 CRISPR 结构的时候，他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。在过去的这一年半时间里，CRISPR 方法已迅速席卷了整个动物王国，成为 DNA 突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每种实验细胞类型中都能起作用，包括人类细胞，小鼠，斑马鱼和果蝇细胞；这种技术也易于操作，已经有两个研究组利用 CRISPR 分析了人类细胞中几乎每个基因单突变（详细报道 Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：张峰建立CRISPR/Cas9人细胞敲除体系）。就在最近，CRISPR 还帮助研究人员完成了携带特殊基因中断（gene disruptions）的工程猴，这项壮举此前曾在小鼠中实现过，但未在灵长类动物中完成过（详细报道 Cell：中国科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴）。 CRISPR 本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不受病毒的侵害。在这些生物基因组中的 CRISPR 位点能表达与入侵病毒基因组序列相匹配的小分子 RNA。当微生物感染了这些病毒中的一种，CRISPR RNA 就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达 CRISPR 相关酶，也就是 Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。 将 CRISPR/Cas 系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：一个 Cas 酶，用于切断靶标 DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一个就是称为导向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，这种分子能通过互补结合靶标。gRNA 也就是细菌细胞中 CRISPR RNA 的一个更短的版本，它能与 Cas 形成复合物，指导 Cas 到达正确的剪切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变 Cas 活性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。 “目前，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，分析细胞中，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利分校的生物化学教授Jennifer Doudna 表示，她与她的同事解析了细菌细胞中 CRISPR 的作用机制。近期，Doudna 研究组利用这种工具，首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。 不过 CRISPR 技术也存在一个主要的缺点，那就是缺乏特异性：一些 gRNA 分子结合的 DNA 只是部分与 gRN 互补。在这一方面，其它基因编辑方法，如锌指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更为具有优势，因为这两者需要识别更长的靶标 DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和细胞表达方面要比 gRNA 难得多，而且研究人员通常还需要验证十几个不同的 TALENS，以及几十个不同的 ZFNs，来证明其中一个有效。 近期《科学家》（The Scientist）杂志汇总了基因编辑过程中 Cas 和 gRNA 的处理过程及解决方案，用于帮助新接触这一技术的研究人员熟悉这项热门技术。 如何 CRISPR 我的靶标？由于 CRISPR 系统并不复杂，因此我们所要做的就是将带有质粒（能表达 Cas 和 gRNA）的细胞进行转染。研究人员可以采用一种 Cas 的变体，即 Cas9，这种酶来自于一种链球菌，由 RNA 进行指引，能无需其他蛋白的帮助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切断与 gRNA 结合的 DNA 链，也能切断其互补链。目前可以从 Addgene 购买 Cas9 质粒（65 美元），将其直接转染入细胞。

5、设计gRNA时为什么AT值要高一点

gRNA又称引导RNA，真核生物中参与RNA编辑的具有与mRNA互补序列的RNA. gRNA分子是能通过正常的碱基配对途径，或通过G—U配对方式与mRNA上的互补序列配对，编辑前的mRNA分子中删除了一个腺嘌呤核苷酸(A)，由gRNA和mRNA形成了一个杂合分子，增加了A·U和U·G碱基对。被删除的A又重新插入杂合分子中的mRNA部分。通过这样编辑后的mRNA分子，比原来的mRNA分子增加了二个U。在翻译成蛋白质时就相当于发生了移码突因。

6、张峰 sgrna设计网站怎么进不去了

我猜你和我一样，保存的是他们上层网址，然后自己点几次才能进入sgRNA的设计界面。
貌似他们把网址改掉了，或是链接bug了。
你用下面这个链接，可以直接进入sgRNA的设计界面：
http://crispr.mit.e/
亲测有效

7、如何提高sgRNA的打靶效率

为进一步提高CRISPR/Cas9系统的打靶效率，比较共质粒或双质粒表达Cas9内切酶和小向导RNA （sgRNA）的不同载体设计对其打靶效率的影响。方法：将针对AAVS1位点的2个sgRNA序列分别插入表达Cas9的质粒pSpCas9上，再将其构建为Cas9-sgRNA二合一的共质粒以及独立表达sgRNA和Cas9的双质粒系统；质粒转染293T细胞后，用T7E1酶切方法检测打靶效率。结果：不经过变性退火的PCR片段也能直接进行T7E1酶切；Cas9-sgRNA共质粒系统的打靶效率显著高于双质粒系统。

8、CRISPR/Case9实验的gRNA怎么设计和构建，求教

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