巢式pcr引物设计网站

1、求助：巢式PCR引物设计

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2、巢式PCR中的引物怎么设计

巢式PCR一般是有两对引物的，一对outer引物，一对inner引物。一般建议为了方便，inner引物直版接根据目标权序列来设计引物（和普通PCR引物设计方式一样），而outer引物则从目标序列前后两端的序列开始设计，也就是说上下游各往前后移动一些碱基开始设计引物。outer和inner引物的设计应含有重叠区域，重叠区域一般为10bp比较合适。如果说你手上只有目标序列，没有目标序列前后的序列信息的话，你可以使用普通引物作为outer引物，之后再从序列内部设计一对inner引物，原则和之前也是一致的，也应含有10个碱基左右的重叠区域。这时候，因为你的inner引物PCR后产物会少一些碱基序列，你可以设计第三对引物，这对引物为outer和Inner引物的拼接序列，然后进行PCR，将缺失的碱基人工补上。

3、巢式PCR的巢式PCR的步骤

第一步复：目标的DNA模板蓝色的制第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片断（图中未显示可能的多种产物）。
第二步：使用图中红色标记的第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。
由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片断包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片断。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。

4、巢式pcr 怎么做

简单呐,主要是设计引物,分为外套引物和内套引物你可以设计单边巢式或者双边巢式的版引物,如果权内套引物为1和2的话,外套可以设计3和4,或者设计3和1配,或者设计3和2配.
打个比方,比如你要扩增的目的基因在第200bp～400bp,内套的引物分别在200bp处（引物1）和400bp（引物2）处.
外套引物可以设计在100bp处（引物3）和600bp（引物4）处（位置看情况自己选,要在200bp前面和400bp后面）.
或者外套引物也可以设计成100bp处（引物3）,然后和400bp处（引物2）的引物配对作为外套引物（引物3,引物2）

5、什么叫巢式PCR

就是多重PCR,第一次获得产物浓度不够,但循环数过多会造成产物质量不好,就会以第一次PCR产物为模板,设计内引物进行第二次扩增,获得高质量产物

6、巢式pcr如何设计引物，巢式pcr怎么做巢式pcr怎么做简单呐，主要

巢式PCR一般是有两对引物的，一对outer引物，一对inner引物。一般建议为了方便，inner引物版直权接根据目标序列来设计引物(和普通PCR引物设计方式一样)，而outer引物则从目标序列前后两端的序列开始设计，也就是说上下游各往前后移动一些碱基开始设计引物。outer和inner引物的设计应含有重叠区域，重叠区域一般为10bp比较合适。如果说你手上只有目标序列，没有目标序列前后的序列信息的话，你可以使用普通引物作为outer引物，之后再从序列内部设计一对inner引物，原则和之前也是一致的，也应含有10个碱基左右的重叠区域。这时候，因为你的inner引物PCR后产物会少一些碱基序列，你可以设计第三对引物，这对引物为outer和Inner引物的拼接序列，然后进行PCR，将缺失的碱基人工补上。

7、巢式PCR的原理

PCR原理〕
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。
发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。
PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

8、如何设计巢氏PCR的第一对引物

可以使用primer5 或者primerdesign设计 还是主要考虑发夹结构，GC含量，Tm值和引物交叉，还有减少引物二版聚体的产生。
如果是扩增启动子权的话，建议选择引物的长度30-35bp，一般试剂盒里有接头引物的，只要在下游已知序列设计引物就可以咯

9、巢式PCR中的引物怎么设计

巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对版）PCR引物扩增权完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常特异。

10、pcr的技术的主要步骤及pcr引物设计的一般原则有哪些

PCR的技术的主要步骤及PCR引物设计的一般原则分述如下：

PCR的技术的主要步骤：

1、DNA变性：（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA。

2、退火：（60℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP为原料，从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸，合成与模板互补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

2、引物设计的基本原则

1、引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。

2、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

3、引物内部不应出现互补序列。

4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

6、引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

7、引物的5 ′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

(10)巢式pcr引物设计网站扩展资料

PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。

在环境检测中，靶核酸序列往往存在于—个复杂的混合物如细胞提取液中，且含量很低，对于探测这种复杂群体中的特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。使用PCR技术可将靶序列放大几个数量级，再用探针杂交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生物群体结构。PCR技术常与其他技术结合起来使用， 如RT-PCR、竞争PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。

第一代PCR就是常见的定性PCR技术，它采用普通PCR仪来对靶基因进行扩增，采用琼脂糖凝胶电泳来对产物进行分析。第二代PCR就是荧光定量PCR技术（Real-Time PCR，qPCR），它通过在反应体系中加入能指示反应进程的荧光试剂来实时监测扩增产物的积累，借助荧光曲线的Cq值来定量起始靶基因的浓度。

第三代PCR技术--数字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一种全新的对核酸进行检测和定量的方法。它采用直接计数目标分子而不再依赖任何校准物或外标，即可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。

PCR芯片技术PCR仪器发展的趋势之一变得更加微型化，PCR芯片就是在这种趋势下诞生的。PCR芯片就是在微型的载体上进行PCR反应，是微型化的PCR仪。芯片PCR不仅节省了大量反应试剂因此降低了实验成本，还有助于提高反应速度。