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1、什么是OneShine64CRISPR/Cas9细胞文库

OneShine64CRISPR/CAS9细胞文库是CRISPR/CAS9基因敲除细胞文库的一种，是将gRNA与CAS9蛋白结合于同一个载体上，然后把设计合成回12万个RNA（靶向约2万个基答因），分别连接到lenti-CRISPR V2载体上，再把12万个质粒混合起来，形成的CRISPR/CAS9基因敲除质粒文库。文库整合到了细胞中，对基因进行大批量的敲除。一个125cm²细胞培养基中约含有10^8个细胞，每个细胞被敲除一个基因，共约2万个基因被敲除。这种细胞还能进行传代。总而言之，就是CRISPR/CAS9基因敲除细胞文库。

2、如何利用cas9制作基因编辑动物

Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9是细菌和古细菌一种copy不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR/Cas9利用一段小 RNA 来识别并进行有效的靶向DNA剪切。主要分为两个组成部分Cas9核酸酶和gRNA 两部分。

3、crispr/cas9 基因敲除，怎样判断grna活性

利用copy基因同源重组进行基因敲除

基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

2.诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计的方式来对动物基因突变的时空特异性进行人为控制、以避免出现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。常见的几种诱导性类型如下：四环素诱导型；干扰素诱导型;激素诱导型;腺病毒介导型。

4、crispr系统中sgrna和grna一样吗

sgrna是single guide RNA（单导向RNA）的缩写。在CRISPR/Cas9系统中sgRNA与gRNA是一个概念。

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是原核生物基因组内的一段重复序列，是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务。

细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR-Cas9系统，利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的基因组上切除，这是细菌特有的免疫系统。

扩展知识：

功能特点：

CRISPR是生物科学领域的游戏规则改变者，这种突破性的技术通过一种名叫Cas9的特殊编程的酶发现、切除并取代DNA的特定部分。这种技术的影响极其深远，从改变老鼠皮毛的颜色到设计不传播疟疾的蚊子和抗虫害作物，再到修正镰状细胞性贫血等各类遗传疾病等等。

该技术具有非常精准、廉价、易于使用，并且非常强大的特点。 

CRISPR来自微生物的免疫系统，这种工程编辑系统利用一种酶，能把一段作为引导工具的小RNA切入DNA，就能在此处切断或做其他改变。以往研究表明，通过这些介入，CRISPR能使基因组更有效地产生变化或突变，效率比TALEN（转录激活因子类感受器核酸酶）等其他基因编辑技术更高。

虽然CRISPR有许多优点，在人类癌细胞系列中，它也可能产生大量“误伤目标”，尤其是对不希望改变的基因做修改。

5、CRISPR-Cas9是如何将特定的变化引入DNA序列的？

gRNA通过碱基互补配对和目标序列结合后，会招募核酸内切酶Cas9对结合的序列进行切割，导致版DNA双链断裂，细权胞随之利用非同源末端连接（NHEJ）和同源重组修复（HDR）对双链DNA进行修复。
非同源末端连接是一种易错易突变的修复途径，容易导致断裂位点插入或缺失数个碱基，从而引起目标基因移码突变或提前终止；
同源重组修复则需要引入外源修复模板，实现精准的基因插入和替换。

6、用cas9基因敲除不同转录本怎么设计grna

这要具体分析，如果这个基因存在可变剪接，那就看这个基因是否有外显子（版不为三的整倍数的权外显子）是这些转录本里共有的，如果是就可以在这个外显子上设计sgRNA，这样就可以敲除掉这个外显子和其后的外显子（因为移码突变导致的提前翻译终止）。如果没有这样的外显子那就只能在不同的外显子上设计多条sgRNA，然后筛选这几个转录本都敲除成功的细胞系或实验动物就可以了（毕竟应用Cas9技术能够实现多基因敲除）。

7、crispr dcas9怎么同时激活和转录

“基因敲除狗”，“基因敲除猪”，CRISPR/Cas9到底是怎样一个技术技术近日，中国科学家利用基因编辑技术——CRISPR/Cas9，对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。一、与诺奖“擦肩而过”的CRISPR/Cas9技术这不是CRISPR/Cas9这项明星技术第一次得到人们的关注。在此之前，有着“豪华版”诺奖之称的“2015年度生命科学突破奖”颁发给了发现基因组编辑工具“CRISPR/Cas9”的两位美女科学家——珍妮弗？杜德娜和艾曼纽？夏邦杰。二人更是获得了2015年度化学领域的引文桂冠奖——素有诺奖“风向标”之称，曾被认为是今年诺贝尔化学奖的最有力竞争者。那CRISPR/Cas9到底是一项什么技术，为何能够获得如此这般青睐，又何以在短短两三年时间内，发展成为生物学领域最炙手可热的研究工具之一，并有近700篇相关论文发表？它将来又会如何影响到我们的生活？CRISPR/Cas9是继“锌指核酸内切酶（ZFN）”、“类转录激活因子效应物核酸酶（TALEN）”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。二、CRISPR/Cas系统的灵感来源CRISPR/Cas9技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统。与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应的“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR/Cas系统实现的。在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的规律间隔的短回文重复序列）。1、“记录”入侵者档案其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。（如图A所示）。图1 CRISPR序列示意图其中，菱形框表示高度可变的间隔序列，正方形表示相对保守的重复序列病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM（Protospacer adjacent motifs-原间隔序列临近基序）。当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内时，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组上CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。2、打击二次入侵者当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPR RNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9技术应运而生，从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。三、CRISPR/Cas9技术的实现需要什么？在CRISPR/Cas9技术中，我们把即将被编辑的细胞基因组DNA看作病毒或外源DNA。基因编辑的实现只需要两个工具——向导RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白。其中，向导RNA的设计并不是随机的，待编辑的区域附近需要存在相对保守的PAM序列（即三碱基序列NGG，其中N可以是任意碱基），而且向导RNA要与PAM上游的序列碱基互补配对。以基因敲除为例，如图3所示，在待敲除基因的上下游各设计一条向导RNA（向导RNA1，向导RNA2），将其与含有Cas9蛋白编码基因的质粒一同转入细胞中，向导RNA通过碱基互补配对可以靶向PAM附近的目标序列，Cas9蛋白会使该基因上下游的DNA双链断裂。对于DNA双链的断裂这一生物事件，生物体自身存在着DNA损伤修复的应答机制，会将断裂上下游

8、用cas9基因敲除不同转录本怎么设计grna

这要抄具体分析，如果这袭个基因存在可变剪接，那就看这个基因是否有外显子（不为三的整倍数的外显子）是这些转录本里共有的，如果是就可以在这个外显子上设计sgRNA，这样就可以敲除掉这个外显子和其后的外显子（因为移码突变导致的提前翻译终止）。如果没有这样的外显子那就只能在不同的外显子上设计多条sgRNA，然后筛选这几个转录本都敲除成功的细胞系或实验动物就可以了（毕竟应用Cas9技术能够实现多基因敲除）。