在线qpcr引物设计网站

1、pcr引物设计的基本原则有哪些

1、引物长度一般为15-30bp，常用的为18-27bp，但不能大于38bp；
2、引物GC含量一般为40%-60%，以45-55%为宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之间，Tm值曲线以选取72度附近为佳，5'到 3’的下降形状也有利于引物与模板的结合；
4、ΔG值（自由能）反应了引物与模板结合的强弱程度，3'端的ΔG值相对要低，且绝对值不要超过9，否则不利于正确引发反应，3'末端双链的ΔG值在0--2kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，但在-6时只达到40%，-8时少于20%，-10时接近于0；
5、错配率一般不要超过100，否则会出现非目的条带。但对于某些特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为340以上，而在错误位点的引发效率为110，并且不好找到其他更合适的引物，那么这对引物是可以接受的；
6、Frq曲线为Oligo6软件新引进的一个指标，解释了序列片段存在的重复几率大小，选取引物时，应该用Frq值相对较低的片段；
7、引物二聚体及发卡结构的能量的绝对值一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体而且会降低引物浓度从而导致PCR不能正常发生；
8、3'端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发，同时3'端最后一个碱基最好不要是A或T，若是，会导致错配；
9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5计算Tm值，也就是退火温度。选择较低Tm值的引物的退火温度为反应的退火温度，最好保证每个引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范围内；
10、模板与稳定性较小的引物之间的Tm的差异越小，PCR的效率越高。因为解链温度也取决于它的长度，如果期待的产物长度等于或小于500bp，选用端的引物（16-18bp），如果产物长5kb，则用24bp的引物；
11、在DNA测序和PCR中最好用5'末端稳定（GC含量多），而3'端不稳定（AT含量多）的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应；
12、引物和产物之间的Tm值相差别太大，20摄氏度范围内最好。
13、对引物的修饰一般在5'端进行，例如加酶切位点，加酶切位点的同时要根据需要添加保护碱基。

2、求助检测基因沉默的qPCR引物设计问题

引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补。在PCR（聚合酶链式反应）技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。
PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。
引物设计有 3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这 3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度（proct length），序列 Tm 值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用 ∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（plexformation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。

3、设计的qpcr引物，如何选取最佳的引物序列

扩增PCR的引物除了通用引物，如16S，18S之外，都是要自己设计的，要根据你要扩增的基因设计一对引物

4、如何用 Pubmed 设计 qPCR 引物

引物大吗？抄 如果二十几个bp以上的话，能查出来 正向引物不变，反向引物找反向互补序列，(就是说AATCGGATCCTCj就要翻成GAGGATCCGATT)把这两个序列用两个空格分开，或者用逗号隔开去blast，为了精确，应该在高级选项限制条件里选择你要的那种生物，你要的那种基因（比如是酶就选择酶那一类）。 然后在结果里认真找哈~~

5、怎样用ucsc设计qpcr引物

如何得到引物序列在人类基因组上的位置信息 1. 引物的长度一般为 15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不应大于 3 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3’端相似性较高的序列 3. 引物 3’端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较大的影响。

6、如何在线设计qPCR引物

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7、普通pcr引物设计和荧光定量pcr引物设计的区别

一、方法不抄同

1、普通pcr引物设计：引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

2、荧光定量pcr引物设计：通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，标记跟踪PCR产物进行实时监测反应，利用与之相适应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度

二、原理不同

1、普通pcr引物设计：为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。

2、荧光定量pcr引物设计：在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测PCR全程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在实时荧光定量PCR中，对全程PCR扩增过程进行实时检测，根据反应时间和荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。

三、注意事项不同

1、普通pcr引物设计：引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。产物不能形成二级结构。引物长度在15~30碱基之间。

2、荧光定量pcr引物设计：实时荧光定量 PCR 仪应安放在湿度较低、灰尘较少、远离水池的平稳台面上，不能有强光直射，室内应通风良好，无腐蚀性气体 

8、如何在线设计qPCR引物

设计引物原则
（1）引物最好在模板cDNA的保守区内设计；
（2）引物长度一般在15~30碱基之间，过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应；
（3）引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，一般计算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值；
（4）引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性；
（5）引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了；
（6）引物扩增长度：一般RT-PCR引物扩增长度在100-200bp,常规PCR扩增长度建议200-500bp。一般PCR产物达到2-3k长度也是可以的，但要考虑到可能引入突变，因此建议使用高保真的聚合酶。

9、如何快速设计多条qPCR引物

1 基因有多种变来体，该怎么设计？
你如果源仅仅检测这个基因的表达量，你可以将引物设计在这多种变体的保守区域内，就是所有变体都包含的区域。如果你明确要检测哪一个变体，就设计在这个变体独有的区域内。

2 引物blast后的产物有多种
你应该是在NCBI上进行的primer blast吧？你只要看到你的引物扩增出来的都是你要的目的基因就好了。在NCBI上有很多标记，一般认为NM的是NCBI上认可的reference的序列，NX是用户上传还未认证的序列，你忽略也是可以的。predicted是指用户预测的序列，建议你还是用NCBI认证的序列。

10、如何用 Pubmed 设计 qPCR 引物

以下与大家分享 qPCR 引物设计的具体流程：
在进行引物设计之前，首先大家都应该了解引物设计需要注意的一些细节与原则，归纳如下：

引物设计原则

引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

要设计引物首先要找到 DNA 序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。

产物不能形成二级结构。

引物长度一般在 15～30 碱基之间。G＋C 含量在 40％～60％ 之间。

碱基要随机分布。

引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。

引物 5′ 端可以修饰。引物 3′ 端不可修饰。

引物 3′ 端要避开密码子的第 3 位。

引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72℃ 左右可使复性条件最佳。

Tm 值的计算有多种方法，如按公式 Tm＝4（G＋C）＋2（A＋T），在 Oligo 软件中使用的是最邻近法 （the nearest neighbor method）。尽可能使用两条引物的 Tm 值相同（最好相差不要超过 5℃），退火温度根据较低的 Tm 值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。而对于较长的引物，Tm 值需要考虑动力学参数、从「最近邻位」的计算方式得到，现有的 PCR 引物设计软件大多数都采用这种方式。

对于 Tm 值的计算有争议的地方是附加序列应不应该计算在内，我觉得有值得商讨的地方。因为从理论上只有最开始的循环引物的附加序列是不与模板链结合的，而在后来的 PCR 反应中，引物的附加序列是和模板链结合了的。

ΔG 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用 3' 端 ΔG 值较低（绝对值不超过 9），而 5' 端和中间 ΔG 值相对较高的引物。引物的 3' 端的 ΔG 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。

引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5 kcal／mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行。

引物的 3' 端要与模板严格配对，而 5' 端碱基没有严格的限制，只要与模板 DNA 结合的部分足够长，其 5' 端碱基可不与模板 DNA 配对而呈游离状态，这样，我们可以在引物的 5' 末端加上酶切位点（引入酶切位点时，要考虑到进行双酶切的共用缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方便下游操作。

引物设计流程

了解了设计原则，接下来我们就看看具体的设计流程，本次讲解应用 pubmed 来设计。比如我们要设计小鼠源性白介素 4（IL－4） 的引物。

首先打开 pubmed， 输入如图，点击搜索：

在搜索结果中选择一个点击进入，得到如下信息：

点击上述界面右侧的 Pick Primers。

点击之后进入如下界面，根据上述引物设计原则里面所述原则，填写好相关的产物长度，引物长度，Tm 值、FASTA sequence 等信息之后，点击 get primers。

点击之后就能得到很多条引物序列啦，根据需要及引物设计原则选择合适的引物序列即可。

引物设计好后，再应用 BLAST 检验一下。步骤如下，打开 pubmed，点击首页下方 BLAST。

将刚刚选择的引物序列输入，如图：

点击 blast，得到：

搜索结果中有我们刚刚查询的 NM-021283.2，说明此序列无误。

另外，我们还可以应用 OligoCalc 来检测引物互补情况，点击网址 http://biotools.nubic.northwestern.e/OligoCalc.html。进入界面输入刚刚选择的引物序列。

点击 Check 即可，结果显示 none，则为无互补情况，引物可行。