1、如何用 Pubmed 设计 qPCR 引物
以下与大家分享 qPCR 引物设计的具体流程：
在进行引物设计之前，首先大家都应该了解引物设计需要注意的一些细节与原则，归纳如下：
引物设计原则
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
要设计引物首先要找到 DNA 序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。
产物不能形成二级结构。
引物长度一般在 15～30 碱基之间。G＋C 含量在 40％～60％ 之间。
碱基要随机分布。
引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。
引物 5′ 端可以修饰。引物 3′ 端不可修饰。
引物 3′ 端要避开密码子的第 3 位。
引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72℃ 左右可使复性条件最佳。
Tm 值的计算有多种方法，如按公式 Tm＝4（G＋C）＋2（A＋T），在 Oligo 软件中使用的是最邻近法 （the nearest neighbor method）。尽可能使用两条引物的 Tm 值相同（最好相差不要超过 5℃），退火温度根据较低的 Tm 值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。而对于较长的引物，Tm 值需要考虑动力学参数、从「最近邻位」的计算方式得到，现有的 PCR 引物设计软件大多数都采用这种方式。
对于 Tm 值的计算有争议的地方是附加序列应不应该计算在内，我觉得有值得商讨的地方。因为从理论上只有最开始的循环引物的附加序列是不与模板链结合的，而在后来的 PCR 反应中，引物的附加序列是和模板链结合了的。
ΔG 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用 3' 端 ΔG 值较低（绝对值不超过 9），而 5' 端和中间 ΔG 值相对较高的引物。引物的 3' 端的 ΔG 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。
引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5 kcal／mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行。
引物的 3' 端要与模板严格配对，而 5' 端碱基没有严格的限制，只要与模板 DNA 结合的部分足够长，其 5' 端碱基可不与模板 DNA 配对而呈游离状态，这样，我们可以在引物的 5' 末端加上酶切位点（引入酶切位点时，要考虑到进行双酶切的共用缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方便下游操作。
引物设计流程
了解了设计原则，接下来我们就看看具体的设计流程，本次讲解应用 pubmed 来设计。比如我们要设计小鼠源性白介素 4（IL－4） 的引物。
首先打开 pubmed， 输入如图，点击搜索：
在搜索结果中选择一个点击进入，得到如下信息：
点击上述界面右侧的 Pick Primers。
点击之后进入如下界面，根据上述引物设计原则里面所述原则，填写好相关的产物长度，引物长度，Tm 值、FASTA sequence 等信息之后，点击 get primers。
点击之后就能得到很多条引物序列啦，根据需要及引物设计原则选择合适的引物序列即可。
引物设计好后，再应用 BLAST 检验一下。步骤如下，打开 pubmed，点击首页下方 BLAST。
将刚刚选择的引物序列输入，如图：
点击 blast，得到：
搜索结果中有我们刚刚查询的 NM-021283.2，说明此序列无误。
另外，我们还可以应用 OligoCalc 来检测引物互补情况，点击网址 http://biotools.nubic.northwestern.e/OligoCalc.html。进入界面输入刚刚选择的引物序列。
点击 Check 即可，结果显示 none，则为无互补情况，引物可行。
2、怎么设计realtime pcr引物
结合网上查阅的一些信息和TaKaRa使用说明书中的引物设计要求，同时结合文献上的论述，总结出Real-time PCR 引物设计的要求及设计步骤。首先向那些以前发布信息的朋友表示感谢！因为有些是引用你们的
1.引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman, Alignment 软件看看结果。
2.引物长度一般在17-25碱基之间，上下游引物不能相差太大。
3.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。
4.引物序列要求：A、T、C、G整体分布尽量均匀，不能有部分AT rich，GC rich（特别是3′），避开T/C（Polypyrimidine）或者A/G（Polypurine）的连续结构。
5 避开引物内部或者两条引物之间3个碱基以上的互补序列，两条引物间的3′避开有2个以上的互补序列。
6.特异性：是用BLAST检索确认引物的特异性。
7.引物5′端可以修饰。
8.两条引物的TM值不能相差太大。TM值的计算使用专用软管：OLIGO：63-68度； Primer3：60-65度
9.引物3′端最好为G或者C，3′尽量避免为T。
10.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol 可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。
11.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.
12.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。
13.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。
14.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。
我们的经验是根据以上要求，使用引物设计的软件Primer 5.0设计引物，当然不可能每一条都符合上述要求（我们构建一些载体时不是只能在编码序列前面加上酶切位点和保护碱基，不是别无选择吗？），从中选取较好的。至于能否用只有看你的运气了。
3、普通pcr与real time pcr引物有区别吗
普通pcr与real time pcr引物没有区别；
荧光定量PCR，其引物和一般引物在构成上是回没有什么区别答的，只是要更加注意引物二聚体、PCR产物大小等问题。染料法不需要其他东西，探针法还需要taqman探针，这个探针的设计是比较有讲究的，并且上面有荧光集团和猝灭基团。
聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。
4、如何在线设计qPCR引物
设计引物原则
（1）引物最好在模板cDNA的保守区内设计；
（2）引物长度一般在15~30碱基之间，过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应；
（3）引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，一般计算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值；
（4）引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性；
（5）引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了；
（6）引物扩增长度：一般RT-PCR引物扩增长度在100-200bp,常规PCR扩增长度建议200-500bp。一般PCR产物达到2-3k长度也是可以的，但要考虑到可能引入突变，因此建议使用高保真的聚合酶。
5、realtime PCR引物和一般引物有何不同
如果你做的事荧光定量PCR，其引物和一般引物在构成上是没有什么区别的内，只是要更加注意引物二聚体、容PCR产物大小等问题。染料法不需要其他东西，探针法还需要taqman探针，这个探针的设计是比较有讲究的，并且上面有荧光集团和猝灭基团。具体设计，一般使用相关软件进行。
6、如何快速设计多条qPCR引物
1 基因有多种变来体，该怎么设计？
你如果源仅仅检测这个基因的表达量，你可以将引物设计在这多种变体的保守区域内，就是所有变体都包含的区域。如果你明确要检测哪一个变体，就设计在这个变体独有的区域内。
2 引物blast后的产物有多种
你应该是在NCBI上进行的primer blast吧？你只要看到你的引物扩增出来的都是你要的目的基因就好了。在NCBI上有很多标记，一般认为NM的是NCBI上认可的reference的序列，NX是用户上传还未认证的序列，你忽略也是可以的。predicted是指用户预测的序列，建议你还是用NCBI认证的序列。
7、用什么软件设计real-time PCR引物
beacon disigner 专门用来设计定量PCR的软件，而且跟primer premier 一样，是傻瓜式操作，比较简单
用primer premier也勉强可以设内计，就比较手动一容点了，一般70到200，尽量让引物跨内含子，就是一个引物处在外显子结合位点，希望对你有帮助！
8、如何设计real-time PCR 引物
你查到人类和小鼠该基因对应的mRNA序列，进行比对，找出高度同源的一段，下面就是常规的real-time PCR引物设计步骤了，你知道的吧？
9、【求助】Real-time PCR 引物设计求助
博凌科为-为你解答：1.跨越内含子主要为了避免抽提、反转录过程中残留回基因组DNA污染的干扰，答因为基因组DNA是不会存在两个外显子连续这样一段序列的，如果引物只在一个外显子上就要冒这种风险2.个人感觉引物能不能工作，上下游引物的Tm值要接近，这个最重要，至于别的发卡，茎环等就要看运气了，不行的话就再试几个，实在不行就用老外文献上的引物好了，记得注明参考文献就行了。good luck