1、实时荧光定量PCR中两种引物的设计有什么要求
参照以下real-time PCR引物设计原则：
1.最好位于编码区5’端的300-400bp区域内，可以用DNAman,Alignment 软件看看结果。
2. 产物不能形成二级结构（自由能小于58.61KJ/mol）。
3.引物长度一般在17-25碱基之间,上下游引物不能相差太大。
4.G+C含量在40%~60%之间，45-55％最佳。
5.碱基要随机分布，尽量均匀。
6.引物自身不能有连续4个碱基的互补。
7.引物之间不能有连续4个碱基的互补。
8.引物5′端可以修饰。
9. 3’端不要以A结尾，3′端不可修饰，而且要避开AT,GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。
10. 引物3′端要避开密码子的第3位。
11.引物整体设计自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能最好小于9KJ/mol。可用oligo 6 软件进行比对看结果的情况。
12.做荧光定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp.
13.引物设计避免DNA污染，最好跨外显子接头区。
14.引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。
15.查看有无假基因的存在。假基因就是无功能的DNA序列，与需要扩增的目的片段长度相似。
16.TM值在55-63度之间。
17. .引物与非特异性扩增序列的同源性最好小于70％或者有8个互补碱基同源。
2、设计qRT-PCR引物时，一个基因有多个变体，要选择哪一个来设计引物才能使定量准确些？
1 基因有多种变体，该怎么设计？
你如果仅仅检测这个基因的表达量，你可以将引物设计在这多种变体的保守区域内，就是所有变体都包含的区域。如果你明确要检测哪一个变体，就设计在这个变体独有的区域内。
2 引物blast后的产物有多种
你应该是在NCBI上进行的primer blast吧？你只要看到你的引物扩增出来的都是你要的目的基因就好了。在NCBI上有很多标记，一般认为NM的是NCBI上认可的reference的序列，NX是用户上传还未认证的序列，你忽略也是可以的。predicted是指用户预测的序列，建议你还是用NCBI认证的序列。
3、请教实时荧光定量PCR高手，我想做两个物种的鼠的同一基因的相对定量并比较，请问引物设计应该注意什么
建议你还是选择CDS区不一样的地方设计引物吧，这样可以避免交叉污染引起的非特异扩增，扩增的序列长度不一定要一样，每个引物你最好设计两三对，然后做一个相对定量看看不同引物的扩增效率，选择比较好的两对引物做后续试验，内参基因的引物不需要跟目的基因的扩增产物一样长，这样你设计引物的时候很受限制，总体产物长度在80-150bp之间都是可以接受的，主要是做相对定量的时候不同引物之间的扩则效率要比较接近，这样才有可比性。
4、实时荧光定量pcr引物怎么设计
1、查找该物种或近缘物种信息，看是否能确定内含子序列的位置，在CDS上设计跨内含子的引物，以避免基因组污染；
2、扩增片段大小最好在200bp左右，太大会影响扩增效率；
3、最好一次分别设计两条上游（距离较近）和下游引物（距离较近），组合成4个扩增片段；
4、用任何方法或软件设计好的引用都要用少量cDNA样本来验证引物扩增效果：主要是有无二聚体？有无非特异性扩增？
5、筛选出一对最满意的引物上机，祝你实验顺利。
5、实时定量PCR引物设计
我的做法是把A基因所属的基因家族进行blast。找出高度保守区域，设计引物
（长点，退火温度适当高点，特异性好些），把设计好的引物进行e-pcr，看有没有非目的扩增，如果没有，就ok
ps：如果你开始所说的其他基因和A有同源序列，那么他们该同类啊
6、新设计的实时定量引物在做实时定量之前需要些什么实
a
引物长度一般在20bp左右，上下游引物碱基长度不要相差超过4个碱基。
b
引物退火温度一般在58度，不同软件TM使用不同的算法，primer3，primer
5，primer
6，primer
express等一般可以设置在55-58度，beacon
design可以设置在65左右。
c
GC含量一般没什么特殊要求，40-60最好，如果不好设计，30-80也是可以的。
d
产物长度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那样和引物二聚体不易区分，超过200bp可能会影响PCR扩增效率。
e
软件给出的引物不能有发卡结构和超过3-4个碱基的匹配，特别是3`端不能有碱基匹配，那样更容易形成二聚体。
f
引物设计好以后，在NCBI上做一个primer-blast，检测一下是否有非特异性扩增。
7、想做实时定量PCR，怎么找内参基因，设计内参基因的引物？
一般是查文献，看看别人用的哪些（可以参考不同物种的，甚至拟南芥的你都可以照搬）
或自己根据基因的重要程度，选择一些house keeping基因作为内参基因
想更精确点，将上面的基因都作为备选，不同处理下的不同样品用多个引物对这些基因进行real time PCR，然后用geNORM这样的软件来评估这些基因作为内参基因的可靠性。
8、如何使用强悍的ENSEMBL和IDT设计实时定量PCR的引物
定量PCR引物设计软件很多，NCBI Primer blast、Real time PCR primer database也很多
9、荧光定量PCR的引物如何设计。。
如果你测定的基因序列未知，可以用同源基因或者别的物种的同类基因序列来设计引物，进行PCR，看看是否能够扩增出产物，并对产物进行确认，判断扩增的特异性。
如果确认无误，就可以进行荧光定量PCR。
10、荧光定量PCR引物设计
完全可以，PCR长度从50bp到数百都可以，不止局限于150-300个碱基对。楼上说的有道理，内但是有一点要容注意，最好计算一下扩增片段的Tm值，这样做溶解曲线的时候，光有一个峰还不够，而且得到的TM和你计算的Tm相吻合才行。
是否在翻译区没有影响。