rtpcr引物设计网站

1、RTPCR的引物设计有什么不同吗

没有严格的要求，只要考虑两方面就行：（1）扩增的特异性；（2）扩增的高效性。所以总体要求引物不能太长，扩增产物不能太长，其他参数综合考虑不能太差。

2、RT-pcr或者qRT-PCR引物设计是用ORF来做模板还是CDs？

qRT-PCR的引物设计使用CDS，最好扩增的片段能包含一个内含子剪切位点，这样可以通过电泳排除扩增基因组DNA的可能性，让定量PCR更准确

3、做RTPCR设计引物需查genebank，但是里面哪些才是我需要的mRNA的序列呢，请高手指点

你找序列信息里，从CDS标志开始的那一段是编码区。
查你那基因的mRNA序列，找CDS就可以了

4、如何在线设计qPCR引物

设计引物原则
（1）引物最好在模板cDNA的保守区内设计；
（2）引物长度一般在15~30碱基之间，过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应；
（3）引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解链温度，一般计算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值；
（4）引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构使引物本身复性；
（5）引物应具有特异性。引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了；
（6）引物扩增长度：一般RT-PCR引物扩增长度在100-200bp,常规PCR扩增长度建议200-500bp。一般PCR产物达到2-3k长度也是可以的，但要考虑到可能引入突变，因此建议使用高保真的聚合酶。

5、如何在线设计qPCR引物

如果反转录体系里面有基因组残留，而且你的引物没有跨内含子，这样的情版况下就很容易造成你的ct偏小（权除了cdna扩增外，基因组的模板也会作为模板进行扩增，导致模板起始量偏高）；cdna逆转后是切除内含子的，而基因组是存在内含子的，如果你的引物设计在了跨两个外显子的区域，则只能扩增cdna而不扩增基因组。
引物不跨外显子设计也可以，但是必须保证你用的逆转录试剂盒里面的gdna
wiper
可以完全去除你的基因组，你实验的时候可以做一个nrt的对照看一下有没有基因组污染。我做好几个基因的引物就没有跨外显子设计，用的是r223
hiscript
ⅱ
q
rt
supermix
for
qpcr(+gdna
wiper)，每次nrt也没有扩增，去除基因组效果不错。

6、如何快速设计多条qPCR引物

1 基因有多种变来体，该怎么设计？
你如果源仅仅检测这个基因的表达量，你可以将引物设计在这多种变体的保守区域内，就是所有变体都包含的区域。如果你明确要检测哪一个变体，就设计在这个变体独有的区域内。

2 引物blast后的产物有多种
你应该是在NCBI上进行的primer blast吧？你只要看到你的引物扩增出来的都是你要的目的基因就好了。在NCBI上有很多标记，一般认为NM的是NCBI上认可的reference的序列，NX是用户上传还未认证的序列，你忽略也是可以的。predicted是指用户预测的序列，建议你还是用NCBI认证的序列。

7、PCR,RT-PCR,实时荧光定量PCR的区别与联系

1、所说的PCR应该就是最常规的PCR，以DNA为模板，通过上下游引物，实现DNA的扩增。

2、RT-PCR一般情况下是指反转录PCR（reverse transcription），尽管有些资料上说实时荧光定量PCR也（realtime fluores-cence quantitative PCR）也简称RT-PCR，但是这是不对的，不推荐。

基本操作过程是将所提取的RNA进行反转录，然后将所获得的cDNA作为模板，设计引物进行扩增，是一种检测基因表达的常用方法。

3、实时荧光定量PCR也就是Real-Time PCR，其最大的作用是检测样品中的初始DNA浓度。

至于三者的关系，RT-PCR和实时定量PCR应该都属于PCR，在RNA实验中，这二者都会应用到。

例如你要比较2个组织中的某基因的表达差异，首先你要提取2个组织的总RNA，然后通过RT-PCR检测该基因是否在2个组织中有表达，然后通过实时定量PCR测定该基因在2个组织中的表达量是否具有显著性差异。

(7)rtpcr引物设计网站扩展资料：

PCR原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

耐热DNA聚合酶-Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸：DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，

而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

8、怎样用ucsc设计qpcr引物

如何得到引物序列在人类基因组上的位置信息 1. 引物的长度一般为 15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不应大于 3 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3’端相似性较高的序列 3. 引物 3’端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较大的影响。

9、做pcr，rtpcr和做克隆基因的引物有何不同

不同点来很多。最简介自回答，是目的不同，侧重点也不同：

普通pcr。只考虑能不能扩增出来就行。

rtpcr。上荧光的话，对引物质量要求高，得做个hplc或者page纯化；其次对引物设计要求高，考虑得率，特异性等因素。

克隆引物。考虑加入常见酶切位点，导入何种目的载体，碱基密码子偏好性等。

10、如何用 Pubmed 设计 qPCR 引物

以下与大家分享 qPCR 引物设计的具体流程：
在进行引物设计之前，首先大家都应该了解引物设计需要注意的一些细节与原则，归纳如下：

引物设计原则

引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。

要设计引物首先要找到 DNA 序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。

产物不能形成二级结构。

引物长度一般在 15～30 碱基之间。G＋C 含量在 40％～60％ 之间。

碱基要随机分布。

引物自身不能有连续 4 个碱基的互补。引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。

引物 5′ 端可以修饰。引物 3′ 端不可修饰。

引物 3′ 端要避开密码子的第 3 位。

引物所对应模板位置序列的 Tm 值在 72℃ 左右可使复性条件最佳。

Tm 值的计算有多种方法，如按公式 Tm＝4（G＋C）＋2（A＋T），在 Oligo 软件中使用的是最邻近法 （the nearest neighbor method）。尽可能使用两条引物的 Tm 值相同（最好相差不要超过 5℃），退火温度根据较低的 Tm 值选定，也可以通过改变引物的长度来平衡两条引物的退火温度。而对于较长的引物，Tm 值需要考虑动力学参数、从「最近邻位」的计算方式得到，现有的 PCR 引物设计软件大多数都采用这种方式。

对于 Tm 值的计算有争议的地方是附加序列应不应该计算在内，我觉得有值得商讨的地方。因为从理论上只有最开始的循环引物的附加序列是不与模板链结合的，而在后来的 PCR 反应中，引物的附加序列是和模板链结合了的。

ΔG 值是指 DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用 3' 端 ΔG 值较低（绝对值不超过 9），而 5' 端和中间 ΔG 值相对较高的引物。引物的 3' 端的 ΔG 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。

引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过 4.5 kcal／mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使 PCR 反应不能正常进行。

引物的 3' 端要与模板严格配对，而 5' 端碱基没有严格的限制，只要与模板 DNA 结合的部分足够长，其 5' 端碱基可不与模板 DNA 配对而呈游离状态，这样，我们可以在引物的 5' 末端加上酶切位点（引入酶切位点时，要考虑到进行双酶切的共用缓冲液，否则给下游工作带来困难）、启动子，方便下游操作。

引物设计流程

了解了设计原则，接下来我们就看看具体的设计流程，本次讲解应用 pubmed 来设计。比如我们要设计小鼠源性白介素 4（IL－4） 的引物。

首先打开 pubmed， 输入如图，点击搜索：

在搜索结果中选择一个点击进入，得到如下信息：

点击上述界面右侧的 Pick Primers。

点击之后进入如下界面，根据上述引物设计原则里面所述原则，填写好相关的产物长度，引物长度，Tm 值、FASTA sequence 等信息之后，点击 get primers。

点击之后就能得到很多条引物序列啦，根据需要及引物设计原则选择合适的引物序列即可。

引物设计好后，再应用 BLAST 检验一下。步骤如下，打开 pubmed，点击首页下方 BLAST。

将刚刚选择的引物序列输入，如图：

点击 blast，得到：

搜索结果中有我们刚刚查询的 NM-021283.2，说明此序列无误。

另外，我们还可以应用 OligoCalc 来检测引物互补情况，点击网址 http://biotools.nubic.northwestern.e/OligoCalc.html。进入界面输入刚刚选择的引物序列。

点击 Check 即可，结果显示 none，则为无互补情况，引物可行。