1、运用倒置荧光显微镜观察生物膜需要盖玻片吗
xianweijing显微镜microscope将微小物体或物体的微细部分高倍放大，以便观察的仪器或设备。它广泛应用于工农业生产及科学研究。生物学和医学工作者在业务中也经常使用显微镜。大致分为光学显微镜和电子显微镜。光学显微镜即以可见光为光源的显微镜。普通的光学显微镜在结构上可分为光学系统和机械装置两个部分。光学系统主要包括目镜、物镜、聚光器、光阑及光源等部分。机械装置主要包括镜筒、镜柱、载物台、镜座、粗细调节螺旋等部分（图1[光学显微镜]）。其基本光学原理如图2[光学显微镜成像原理模式图],图中左边小的凸透镜代表短焦距的一组透镜，称物镜。右边大的凸透镜代表长焦距的一组透镜，称目镜。被观察的物体(AB)放在物镜焦点(f)稍外的地方。物体的光线通过物镜后在目镜焦点(f)稍内方形成一个倒立的放大实像(BA)。观察者的眼睛通过目镜将该实像(BA)进一步放大为一个倒立的虚像(BA)。目镜位于显微镜筒的上方，一般由两个凸透镜构成。它除了进一步扩大物镜所形成的实像之外，也限制了眼睛所观察的视野。按放大率分,常用目镜有5倍、10倍和15倍三种。物镜一般位于显微镜筒的下方，接近所观察的物体。由8～10片透镜组成。其作用一是放大(给物体造成一个放大的实像）,二是保证像的质量,三是提高分辨率。常用物镜可按放大率分为低倍(4×)、中倍(10×或20×)、高倍(40×)和油浸物镜(100×)。多个物镜共同镶在换镜转盘上，可以按需要转动转盘选择不同倍数的物镜。显微镜的放大倍数为目镜倍数乘物镜倍数，如目镜为10倍，物镜为40倍,则放大倍数为40×10倍（放大400倍）。优良的显微镜可放大2000倍，可分辨相距1×10cm的两点。当白光通过凸透镜时,波长较短的光（蓝紫色）,其折射度大于长波长的光（红橙色），因此，成像时在像周出现各色光谱围绕,并且有一圈蓝色或红色的辉光,这种颜色上的缺陷称为色差。由于光线进入（和离开）透镜镜面各部分的角度不同，从透镜四周透过的光线与从透镜中心透过的光线相比，其折射角度较大。因此，成像时在像周出现模糊而歪曲的影像。这种成像面弯曲的缺陷称为球面差。一系列形状、结构和距离不同的凸和凹透镜组互相配合，便能最大限度地纠正色差和球面差，形成一个明亮、清晰而准确的影像。这就是目镜或物镜分别由一组透镜构成的缘故。这种透镜称为平场消色差透镜。光线从一种介质（如空气）投射到另一种较为致密的介质(如玻璃)中时会弯向“法线”（与介质交界面垂直的一条线）,如图3[光线通过物镜时的情况]中的BOA线。光线由致密介质(玻璃)进到不致密介质(空气)中时会偏离“法线”，如AOB线(图3a)当光线穿过聚光镜玻璃(折射率为1.51)进入空气时同样会偏离,向外折射,因此进入物镜的光量减少很多，像的分辨力也降低。使用100倍物镜时,如果在物镜和盖玻片之间充以油液（折射率同样为1.51）以隔绝空气，则光线几乎可以不折射地进入物镜，这就增加了像的亮度和分辨率。这种物镜称为油浸物镜(图3b)。聚光器位于显微镜台的下方，可会聚来目光源的光线，将光量集中于标本，使标本受到光强适度的均匀照射。聚光器的下端装有孔径光阑（光圈）以控制光束的粗细。普通光学显微镜的照明光源位于聚光器的下方，为特制的照度均匀的强光灯泡，并且配有可变电阻，可以改变光线的强度。由于普通光学显微镜的光源光线自镜体下方向上透射，通过聚光镜、物镜，达到目镜，因此在医学及生物学研究中必须将被观察的样品切成能透过光线的、厚约6m的薄片，并且要进行染色以显示不同的组织和细胞等细微结构。整个加工过程称常规组织制片技术，包括选取适当的组织材料经甲醛（福尔马林）液固定，逐级酒精脱水，石蜡包埋，用切片机将组织切成薄片裱在玻璃片上，再经苏木素―伊红染料着色，最后将组织玻片封固在光学树脂胶内。制好的组织玻片可长期保存。显微镜的目镜和物镜安装在镜筒的两端，它们的距离是固定的。将组织玻片放在载物台上，旋转粗调螺旋使载物台接近物镜。组织切片进入物镜第一焦平面，目镜内即可见标本内的组织影像。然后用细调螺旋使目镜内的影像清晰即可进行观察。改换放大倍数时就要调换目镜或物镜。医学和生物学常使用的光学显微镜有下列12种：暗视野显微镜在普通光学显微镜台下配一个暗视野聚光器（图4）,来自下面光源的光线被抛物面聚光器反射，形成了横过显微镜视野而不进入物镜的强烈光束。因此视野是暗的，视野中直径大于0.3m的微粒将光线散射，其大小和形态可清楚看到。甚至可看到普通明视野显微镜中看不见的几个毫微米的微粒。因此在某些细菌、细胞等活体检查中常常使用。实体显微镜由双筒目镜和物镜构成。放大率7～80倍。利用侧上方或下方显微镜灯照明。在目镜内形成一个直立的放大实像，可以观察未经加工的物体的立体形状、颜色及表面微细结构,并能进行显微解剖操作,也可以观察生物机体的组织切片。荧光显微镜在短波长光波(紫外光或紫蓝色光,波长250～400nm）照射下，某些物质吸收光能，受到激发并释放出一种能量降级的较长的光波（蓝、绿、黄或红光，波长400～800nm），这种光称荧光。某种物质在短光波照射下即可发生荧光，如组织内大部分脂质和蛋白质经照射均可发出淡蓝色荧光，称为自发性荧光。但大部分物质需要用荧光染料（如吖啶橙、异硫氰酸荧光素等）染色后，在短光波照射下才能发出荧光。荧光显微镜的光源为高压汞灯，发出的紫外光源经过激发滤光片(此滤光片可通过对标本中荧光物质合宜的激发光)过滤后射向普勒姆氏分色镜分色镜将激发光向下反射,通过物镜投射向经荧光染料染色的标本。染料被激发并释放出荧光,通过物镜,穿过分色镜和目镜即可进行观察。目镜下方安置有屏障滤片(只允许特定波长的荧光通过)以保护眼眼及降低视野暗度(图4[荧光显微镜光学原理])。荧光显微镜的特点是灵敏度高，在暗视野中低浓度荧光染色即可显示出标本内样品的存在，其对比约为可见光显微镜的100倍。30年代荧光染色即已用于细菌、霉菌等微生物及细胞、纤维等的形态观察和研究。如用抗酸菌荧光染色法可帮助在痰中找到结核杆菌。40年代创造了荧光染料标记蛋白质的技术，这种技术现已广泛应用于免疫荧光抗体染色的常规技术中，可检查和定位病毒、细菌、霉菌、原虫、寄生虫及动物和人的组织抗原与抗体，可用以探讨病因及发病机理，如肾小球疾病的分类及诊断，乳头瘤病毒与子宫颈癌的关系等。在医学实验研究及疾病诊断方面的用途日益广泛。偏光显微镜从光源发出的光线通过空气和普通玻璃时，在与光线垂直的平面内的各个方向以同一振幅进行振动并迅速向前方传递，这是光的波动性原理。空气与普通玻璃为各向同性体，又称单折射体。如果该光源的光通过一种各向异性体（又称双折射体）时，会将一束光线分为各只有一个振动平面的，而且振动方向互相垂直的两束光线。这两束光线的振动方向、速度、折光率和波长都不相同。这样只有一个振动平面的光线称偏振光。偏光显微镜即利用这一现象而设计。偏光显微镜内，在物镜与目镜间插入一个检偏镜片，光源与聚光器间镶有起偏镜片，圆形载物台可以作360°旋转（图5[偏光显微镜光学原理]）。起偏与检偏镜片处于正交检偏位时，视野完全变黑。将被检物体放在显微镜台上。若被检物为单折射体，则旋转镜台，视野始终黑暗。若旋转镜台一周，视野内被检物四明四暗，则说明被检物是双折射体。许多结晶物质（如痛风结节中的尿酸盐结晶、尿结石、胆结石等），人体组织内的弹力纤维、胶原纤维、染色体和淀粉样原纤维等都是双折射体，可借偏振光显微镜术检验，进行定性和定量分析。位相显微镜又称相差显微镜或相衬显微镜。普通光学显微镜之所以看不见未染色的组织、细胞和细菌、病毒等活机体的图像，是因为通过样品的光线变化差别（反差）很小。标本染色后改变了振幅（亮度）和波长（颜色），影响了反差而获得图像。但是染色会引起样品变形，也可使有生命的机体死亡。要观察不染色的新鲜组织、细胞或其他微小活体必须使用位相显微镜。位相显微镜的原理是两个光波因位相差而互相干涉，出现光波强弱和反差的改变而成可见影像。点光源发出的光线可以表现为正弦波图形(图6a[位相显微镜])。两个波峰间的距离为波长,波的振幅表示光的亮度(振幅大、亮度高)。设想同一光源发出的两条光波,分别同时通过空气及某种透明介质。在通过一定厚度的某种透明介质时，光波的速度就会降低，但是光的亮度未变。光波在通过该透明介质后比一直在空气中前进的另一条光波迟滞了波长，因而两条光波出现了位相的变化（位相差）。但人眼不能分辨这两条平行光线的位相差。如果这两条光波射到光屏的同一点上，而且一条光波比另一条光波迟滞了半个波长，即两条光波因位相相反而互相干涉抵消则光线消失，或者相对振幅相互影响而光线减弱。如果一条光波虽然迟滞了一个波长,但两条光波位相相同,则因波的叠加而光线增强。位相显微镜的基本结构与普通光学显微镜相同。不同之处在于：①物镜镜头上面，在物镜第二焦平面装有一块圆盘状的位相板（图6b[位相显微镜]）。②聚光器下面，在聚光器第一焦平面装有环形光束，光束上刻有狭窄的缝隙可通过环形强光(图6c[位相显微镜])。如图6d所示，环形光束A点发出的光线经过聚光器后成为平行光线。光线通过载物台上的样品时，因样品内各个质点(如b点)的折射率不同而受到干涉，发生衍射,即分为未偏向波（实线）和偏向波(虚线)。未偏向波通过物镜聚焦于位相板A点上成像，然后通过位相板，均匀地分布在标本像平面上成为背景。偏向波通过物镜后从位相板A点周围通过位相板同样聚焦在像平面的B上。换句话说，未偏向波和偏向波是分别通过位相板的不同部位。在位相板上不同的区域涂有不同的涂层，可以分别改变未偏向波或偏向波的速度和亮度，由此两种光波出现了位相差，差了半个波长或一个波长，它们在像平面的合波就出现明暗对比，样品内的各个细节也就能看得见。总之，位相显微镜是利用样品中质点折射率的不同或质点厚度的不等，产生光线的相位差，使新鲜标本不必染色就可以看到，而且能够观察到活细胞内线粒体及染色体等精细结构，还可以应用于霉菌、细菌、病毒等更微小活体的研究，进行标本形态、数量、活动及分裂、繁殖等生物学行为观察，并可进行量度与比较。倒置式显微镜普通显微镜镜的物镜头方向向下接近标本。倒置式显微镜的物镜镜头则处于垂直向上的位置，因此目镜和镜筒的纵轴与物镜的纵轴呈45度角。载物台面积较大，在物镜上方，载物台上方有一个长焦距聚光器和照明光源。物镜和聚光器可装配位相显微镜的附件。放大率16～80倍。组织培养瓶和培养皿可以直接放在载物台上，进行不染色新鲜标本及活体、细胞的形态、数量和动态观察。可进行多孔微量生物化学及免疫反应平板的结果观察。倒置式显微镜可换用普通亮视野光学镜头；可装配偏振光、微分干涉差、荧光附件进行观察。微分干涉差显微镜(DIC)又称干扰或干涉显微镜。能看到和测定微小的位相变化，与位相显微镜相似，使无色透明的标本具有明暗和颜色的变化，从而增强反差。在普通光学显微镜的基本结构上安装偏光和干涉部件，以及360°旋转载物台它又利用偏振光的干涉原理。如图7[微分干涉差显微镜光学原理]所示,在光源上方安置有起偏镜片和光束分解棱镜。从起偏镜片出来的直线偏振光通过光束分解棱镜后，分成互相垂直振动的两条直线偏振光。两条光线经聚光器折射后射向样品。因样品内各个质点的折射射率不同，部分光波的位相改变及因干涉而发生横向偏移。两条光线通过物镜后经第二组光束分解棱镜相合并，由检偏镜发生干涉。终末像的每一个点是由物体上同一点的两个互相重叠的不同图像构成的一种混合像，从而使肉眼得以辨识。微分干涉差显微镜同样可以观察到在普通亮视野中看不见的无色透明物体,可以观察细胞、细菌等活体,而且影像呈立体感，较位相显微镜的影像更细致、更逼真。可用它对活细胞的各个部位作更精细的研究。如果用白光照明，不同位相表现为各种颜色，转动载物台，颜色会发生变化。单色光照明产生明暗反差，各种成分呈现不同的对比度。微分干涉差显微镜又可以作为一种高度精密的超微量光学天平来使用，用以估测的干物体的精确质量可以小到1×克。当细胞中所含固体物质的浓度增加百分之一时，其折射率相应增加0.0018。细胞各相成分的折射率可以根据它与相关区域（悬浮液区）间位种的不同而估计，从而可进一步算出一个细胞中某些成分的干燥重量。摄影显微镜现代高质量显微镜均可安装显微照相的各种附件，可以及时完整地保留科学资料。用于照相的显微镜要求光学系统和机件结构精密，镜体坚固稳定。它装配三目镜筒，其中两个45°角观察用目镜镜筒和一个中央垂直镜筒安装135照相机、曝光测量附件、照相目镜及取景镜头，可以进行取景和调焦。聚光器能调节视场中心并配有孔径光阑使视场照明均匀。镜座有可调节视场光阑，有电压表和电压显示灯。有可变电阻调节照明亮度。照明光源为6～12伏40～100瓦卤素灯泡。80年代的自动曝光显微照相装置具有自动卷片，自动测光、自动控制曝光，测量和调整色温以及倒易律失效的补偿等各项功能，均用电子计算机自动控制，可以进行黑白感光片、彩色负片和彩色幻灯片的投照。中央垂直镜筒又可以安装电视摄像装置或16mm电影摄影机及控制装置，可对活体标本进行定时定格或连续的摄影记录。万能研究用摄影显微镜系统集普通亮视野、暗视野、偏振光、荧光、位相、微分干涉差、显微摄影等各项功能于一个系统中。还有电子计算机控制的低倍摄影自动聚焦、自动转换物镜、聚光器自动匹配、自动调整光源亮度等功能。机身安装两个135照相机,一个4×5英寸大版照相机。可另外安装电视摄像和16mm电影摄影装置，同样具有自动卷片、自动测光、自动控制曝光、测量和调节色温、倒易体失效补偿等多项功能。电子显微镜光学显微镜的分辨本领由于所用光波的波长而受到限制。小于光波波长的物体因衍射而不能成像。最高级的光学显微镜的分辨本领的限度约200nm(2000)。为了突破这一限度，可采用电子射线来代替光波。电子微粒以高速运动时，其行为类似光波的传播过程。运动电子的波长随其速度而定，在增压达50万伏时，其波长为0.001nm(0.01),即电子射线的波长约为可见光的十万分之一,其分辨本领的极限约为4，其放大倍数比最高级的光学显微镜要高很多级。以电子射线为电子光源的显微镜称为电子显微镜。现代医学和生物学使用的电镜分辨率为5～10,即放大率为10～20万倍。由于标本厚薄不同，超薄切片机切出的很薄的标本，可用透射式电子显微镜观察。不能切得很薄的标本可用扫描式电镜进行观察。透射式电子显微镜(TEM)是最常用的电子显微镜，由电子枪、电磁透镜系统、荧光屏（或照相机）、镜筒、镜座、变压器、稳压装置、高压电缆、真空泵系统、操纵台等部分组成电子枪相当于光学显微镜中的光源,供应和加速从阴极热钨丝发射出来的电子束。电镜所用的电压一般在20～30万伏特，才足以使电子枪里的电子以高速飞出。电子通过聚光透镜，达到标本上，因为标本很薄，高速电子可以透过，并且由于标本各部分的厚度或密度不同，通过的电子就有疏密之分。电压需要严格稳定才能使成像稳定，很小的电压改变就会引起严重干扰。像的亮度可以通过电子枪来控制。电磁透镜组相当于光镜中的聚光器、物镜及目镜系统。电子束通过各个电磁透镜的圆形磁场的中心时可被会聚而产生像。电镜的透镜系统由4组电磁透镜组成,包括聚光透镜、物镜、中间透镜和投射透镜(目镜)。可改变聚光透镜的电流使电子束对标本聚焦并提供“照明”。物镜靠近标本的焦点上。通过物镜、中间镜和投射镜的三级放大，能在一定的距离处得到高倍的放大像，最终形成的像投射到荧光屏上。在荧光屏部位可换用黑白胶片以制取相片底板。改变电磁线圈中的电流量从而使电磁透镜调焦，并产生不同的放大率（图8[透射式电子显微镜]）。为了尽量减少电镜中电子与空气分子相碰撞而产生散射的机会，镜筒中的真空度要求很高，因此密封的镜筒与真空泵相连。由于标本需置于真空的镜筒内，因此不能检查活材料。光镜主要利用可见光波作为光源，样品染色后改变了光的波长(颜色)和振幅（亮度），影响了反差从而得到图像。电镜使用电子射线。电子束的穿透力不强，所以供电镜检查的标本必须切到薄至50～100nm厚度的切片。电镜切片的制作步骤与光镜切片类似，也是由固定、脱水、包埋、切片和染色等程序组成：首先从欲观察的标本上取材,体积约1。通过戊二醛和四氧化锇双固定后，逐级酒精（或丙酮）脱水,环氧树脂包埋,超薄切片机切片。在电镜中像的形成是组织片各个部分对电子束的电子产生不同散射的结果，标本中致密的地方(细节)散射强。可使用各种重金属盐染色以增加反差，常用的是醋酸铀和枸橼酸铅复染。由于电子束穿不透玻璃，染好的薄膜切片放在小铜网格上作电镜观察。冷冻蚀刻技术是50年代发明、后来经过改进的一种新的电镜标本加工技术。其主要原理是把液氮内快速超低温(-200℃)冷冻的生物标本放在真空冷冻装置里断裂，从而将不同部位的细胞器内部结构暴露出来，表现出高低不等的三维结构。在新形成的折断面上喷镀一层铂金碳膜（复型）。将已镀膜标本在强酸或强碱性腐蚀溶液里消化，复型膜即漂浮、经打捞、清洗，放在小铜网上进行电镜观察和照相。冷冻蚀刻技术在细胞生物膜结构（如细胞膜、线粒体、内质网等）的研究上发挥了重大作用。扫描式电子显微镜(SEM)标本较厚的表面要产生一个电子光学图像就要采用电子扫描法（图9[扫描电子显微镜结构示意图]）。扫描电镜的电子枪和电磁透镜的结构原理类似透射电镜。电子枪产生的大量电子通过三组电磁透镜的连续会聚形成一条很细的电子射线（电子探针）。这条电子射线在电镜筒内两对偏转线圈的作用下，顺序在标本表面扫描。由于来自锯齿波发生器的电流同时供应电镜镜筒内的和显示管的两组偏转线圈，使得显示器的电子射线在荧光屏上产生同步扫描。从标本上射出的电子经探测器收集，被视频放大器放大并控制显示管亮度。因此在荧光屏上扫描的亮度被标本表面相应点所产生的电子数量所控制，因而在荧光屏上显示出标本的高倍放大像。通过控制两套偏转线圈的电流便可控制放大率的倍数。另外安装有一个同样的照相用同步扫描显示管。扫描电镜标本制作中，既要脱水又要基本保持其自然状态，因此使用标本的临界冷冻干燥技术：将组织表面清洗干净，经戊二醛和四氧化锇双重固定，逐级丙酮脱水。由于乙酸戊酯与液化Co置换十分容易,因此首先用梯度乙酸戊酯置换丙酮。然后将标本放入密闭耐压室内，导入液态Co，使之浸没标本。很快Co将标本内乙酸戊酯完全置换出来，将后者排出耐压室。同时耐压室内的液态Co与迅速蒸发的气态Co分子之间的互变达到动态平衡。使温度逐渐上升,液态Co蒸发加快而密度相应降低。达到Co的临界温度31.1℃时,气、液二相密度相同，二相的差异完全消失，即达到相的平衡，此时表面张力为零。使温度继续保持在稍高于临界温度的条件下，缓慢排出Co气体,当Co排尽时,标本即已干燥。取出干燥好的标本，经真空喷镀一层碳合金，或放入离子镀膜机内镀铂和金，以增加标本的导电能力，加强反差和增强标本的稳定性。然后即可进行扫描电镜观察。扫描电镜具有分辨率高、景深长、视野广、显示三维立体结构、便于观察和标本制备简单等许多优点，在生物学及医学上应用愈来愈多，用以观察和研究生物标本的表现形态和内部立体结构。扫描电镜的分辨本领已达到70的水平，已可以直接观察脱氧核糖核酸(DNA)的分子结构。
2、利用光学显微镜观察细胞膜时发现其具有暗---亮---暗三层结构
a只有电镜下才能看到细胞膜的亚显微结构
b正确
c只有在酸性条件并且水浴加热下，才能将DNA染成蓝色
3、生物膜镜检
生物转盘旋转时,污水在反应槽中顺盘片间隙流动,污水中的有机物被转盘上的生物膜所吸附.当盘片转离水面时,盘层表面形成一层污水薄膜,空气中的氧不断地溶解到水膜中,生物膜中微生物吸收溶解氧,氧化分解被吸附的有机污染物.盘片每转为一周,即进行一次吸附—吸氧—氧化分解的程.转盘不断转动,污染物不断地被氧化分解,生物膜也逐渐变厚,衰老的生物膜在水流剪切力作用下脱落,并随污水排出沉淀池.转盘转动也使槽中污水不断地搅动充氧,脱落的生物膜在槽中呈悬浮状态,继续起净化作用,因此,生物转盘兼有活性污泥池的功能.
4、请问生物膜做扫描电镜该怎么做固定处理？
扫描电子显微镜的设计思想和工作原理，早在1935年便已被提出来了。1942年，英国首先制成一台实验室用的扫描电镜，但由于成像的分辨率很差，照相时间太长，所以实用价值不大。经过各国科学工作者的努力，尤其是随着电子工业技术水平的不断发展，到
1956年开始生产商品扫描电镜。近数十年来，扫描电镜已广泛地应用在生物学、医学、冶金学等学科的领域中，促进了各有关学科的发展。
一．扫描电镜的特点
和光学显微镜及透射电镜相比，扫描电镜具有以下特点：
(一) 能够直接观察样品表面的结构，样品的尺寸可大至120mm×80mm×50mm。
(二) 样品制备过程简单，不用切成薄片。
(三) 样品可以在样品室中作三度空间的平移和旋转，因此，可以从各种角度对样品进行观察。
(四) 景深大，图象富有立体感。扫描电镜的景深较光学显微镜大几百倍，比透射电镜大几十倍。
(五) 图象的放大范围广，分辨率也比较高。可放大十几倍到几十万倍，它基本上包括了从放大镜、光学显微镜直到透射电镜的放大范围。分辨率介于光学显微镜与透射电镜之间，可达3nm。
(六) 电子束对样品的损伤与污染程度较小。
(七) 在观察形貌的同时，还可利用从样品发出的其他信号作微区成分分析。
二．扫描电镜的结构和工作原理
(一) 结构
1．镜筒
镜筒包括电子枪、聚光镜、物镜及扫描系统。其作用是产生很细的电子束(直径约几个nm)，并且使该电子束在样品表面扫描，同时激发出各种信号。
2．电子信号的收集与处理系统
在样品室中，扫描电子束与样品发生相互作用后产生多种信号，其中包括二次电子、背散射电子、X射线、吸收电子、俄歇(Auger)电子等。在上述信号中，最主要的是二次电子，它是被入射电子所激发出来的样品原子中的外层电子，产生于样品表面以下几nm至
几十nm的区域，其产生率主要取决于样品的形貌和成分。通常所说的扫描电镜像指的就是二次电子像，它是研究样品表面形貌的最有用的电子信号。检测二次电子的检测器(图15(2)的探头是一个闪烁体，当电子打到闪烁体上时，1就在其中产生光，这种光被光导管传送到光电倍增管，光信号即被转变成电流信号，再经前置放大及视频放大，电流信号转变成电压信号，最后被送到显像管的栅极。
3．电子信号的显示与记录系统
扫描电镜的图象显示在阴极射线管(显像管)上，并由照相机拍照记录。显像管有两个，一个用来观察，分辨率较低，是长余辉的管子；另一个用来照相记录，分辨率较高，是短余辉的管子。
4．真空系统及电源系统
扫描电镜的真空系统由机械泵与油扩散泵组成，其作用是使镜筒内达到 10(4～10(5托的真空度。电源系统供给各部件所需的特定的电源。
(二) 工作原理
从电子枪阴极发出的直径20(m～30(m的电子束，受到阴阳极之间加速电压的作用，射向镜筒，经过聚光镜及物镜的会聚作用，缩小成直径约几毫微米的电子探针。在物镜上部的扫描线圈的作用下，电子探针在样品表面作光栅状扫描并且激发出多种电子信号。这些电子信号被相应的检测器检测，经过放大、转换，变成电压信号，最后被送到显像管的栅极上并且调制显像管的亮度。显像管中的电子束在荧光屏上也作光栅状扫描，并且这种扫描运动与样品表面的电子束的扫描运动严格同步，这样即获得衬度与所接收信号强度相对应的扫描电子像，这种图象反映了样品表面的形貌特征。第二节 扫描电镜生物样品制备技术大多数生物样品都含有水分，而且比较柔软，因此，在进行扫描电镜观察前，要对样品作相应的处理。扫描电镜样品制备的主要要求是：尽可能使样品的表面结构保存好，没
有变形和污染，样品干燥并且有良好导电性能。
一．样品的初步处理
(一) 取材
取材的基本要求和透射电镜样品制备相同，可参考第十四章超薄切片技术中所提的要求。但是，对扫描电镜来说，样品可以稍大些，面积可达8mm×8mm，厚度可达5mm。对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等，可固定在滤纸或卡片纸上，以充分暴露待观察的组
织表面。
(二) 样品的清洗
用扫描电镜观察的部位常常是样品的表面，即组织的游离面。由于样品取自活体组织，其表面常有血液、组织液或粘液附着，这会遮盖样品的表面结构，影响观察。因此，在样品固定之前，要将这些附着物清洗干净。清洗的方法有以下几种：
1．用等渗的生理盐水或缓冲液清洗；
2．用5%的苏打水清洗；
3．用超声震荡或酶消化的方法进行处理。例如清洗肠粘膜表面的粘液，可用下面的方法：
清洗液配方：透明质酸酶 300 (gα—糜蛋白酶 10 mg生理盐水 100 ml清洗液的pH为5.5～6。清洗的方法是将样品浸泡在配好的清洗液中，边浸泡边震荡30分钟，最后用双蒸水洗3次。无论用哪种清洗方法，注意在清洗时不要损伤样品。
(三) 固定
固定所用的试剂和透射电镜样品制备相同，常用戊二醛及锇酸双固定。由于样品体积较大，固定时间应适当延长。也可用快速冷冻固定。
(四) 脱水
样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水，然后进入中间液，一般用醋酸异戊酯作中间液。
二．样品的干燥
扫描电镜观察样品要求在高真空中进行。无论是水或脱水溶液，在高真空中都会产生剧烈地汽化，不仅影响真空度、污染样品，还会破坏样品的微细结构。因此，样品在用电镜观察之前必须进行干燥。干燥的方法有以下几种：
(一) 空气干燥法
空气干燥法又称自然干燥法，就是将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。这种方法的最大优点是简便易行和节省时间；它的主要缺点是在干燥过程中，组织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。因此，该方法一般只适用
于表面较为坚硬的样品。
(二) 临界点干燥法
临界点干燥法是利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全汽化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的。这样就可以避免表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构。此法操作较为方便，所用的时间也不算长，一般约2～3小
时即可完成，所以是最为常用的干燥方法。但用此法，需要特殊仪器设备。
临界点干燥是在临界点干燥仪中进行的，操作步骤如下：
1．固定、脱水：按常规方法进行。如样品是用乙醇脱水的，在脱水至100%后，要用纯丙酮置换15～20分钟。
2．转入中间液：由纯丙酮转入中间液醋酸异戊酯中，时间约15～30分钟。
3．移至样品室：将样品从醋酸异戊酯中取出，放入样品盒，然后移至临界点干燥仪的样品室内，盖上盖并拧紧以防漏气。
4．用液体二氧化碳置换醋酸异戊酯：在达到临界状态(31(C , 72.8大气压)后，将温度再升高10(C，使液体二氧化碳气化，然后打开放气阀门，逐渐排出气体，样品即完全干燥。
(三) 冷冻干燥法
冷冻干燥法是将经过冷冻的样品置于高真空中，通过升华除去样品中的水分或脱水剂的过程。冷冻干燥的基础是冰从样品中升华，即水分从固态直接转化为气态，不经过中间的液态，不存在气相和液相之间的表面张力对样品的作用，从而减轻在干燥过程中对样
品的损伤。冷冻干燥法有两种，即含水样品直接冷冻干燥和样品脱水后冷冻干燥。
1．含水样品直接冷冻干燥法
1.1 取材固定：按常规方法进行。
1.2 置于冷冻保护剂中：将样品置于冷冻保护剂中浸泡数小时。常用的冷冻保护剂为10%～20%二甲基亚砜水溶液，或15%～40%甘油水溶液。
1.3 骤冷：将经过保护剂处理的样品迅速投入用液氮预冷至(150(C的氟利昂冷冻剂中，使样品中的水分很快冻结。
1.4 干燥：将已冻结的样品移到冷冻干燥器内已预冷的样品台上，抽真空，经几小时或数天后，样品即达到干燥。
本方法不需要脱水，避免了有机溶剂对样品成分的抽提作用，不会使样品收缩，也是较早使用的方法。但是，由于花费时间长，消耗液氮多，容易产生冰晶损伤，因此未被广泛应用。
2．样品脱水后冷冻干燥
样品用乙醇或丙酮脱水后过渡到某些易挥发的有机溶剂中，然后连同这些溶剂一起冷冻并在真空中升华而达到干燥。和前一种方法比较，本方法的优点是不会产生冰晶损伤，
且干燥时间短。不足之处是有机溶剂对样品成分有抽提作用，造成部分内含物丢失。乙腈(acetonitrile)真空干燥法：这是一种利用乙腈在急速蒸发时会冷却固化的性质将样品干燥的方法。其操作步骤如下：
(1). 固定、水洗：按常规方法进行。
(2). 乙腈置换：使用50%?70%?80%?90%的乙腈水溶液置换，最后用100%乙腈代替，每步骤15～20分钟。
(3). 干燥：至纯乙腈时，放入真空镀膜台抽真空，乙腈和样品在真空中很快致冷而被冻结(冻结的温度为(45(C)，变成冰状固体。然后继续抽真空，使冻结的乙腈升华，约需30分钟，样品即达干燥。
样品干燥后要粘在样品台上。对于不镀膜而直接观察的样品，必须用导电胶来粘固；对于要镀膜的样品，则可以用胶水或万能胶来代替，微细的样品如粉末、纤维等也可用双面胶纸来粘贴。
三．样品的导电处理
生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不带电，导电性能也差。用扫描电镜观察时，当入射电子束打到样品上，会在样品表面产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影响对图象的观察和拍照记录。因此在观察之前要进行导电处理，使样品表面导电。常用的导电方法有以下几种：
(一) 金属镀膜法
金属镀膜法是采用特殊装置将电阻率小的金属，如金、铂、钯等蒸发后覆盖在样品表面的方法。样品镀以金属膜后，不仅可以防止充电、放电效应，还可以减少电子束对样品的损伤作用，增加二次电子的产生率，获得良好的图象。
1．真空镀膜法
真空镀膜法是利用真空 膜仪进行的。其原理是在高真空状态下把所要喷镀的金属加热，当加热到熔点以上时，会蒸发成极细小的颗粒喷射到样品上，在样品表面形成一层金属膜，使样品导电。喷镀用的金属材料应选择熔点低、化学性能稳定、在高温下和钨不起作用以及有高的二次电子产生率、膜本身没有结构。现在一般选用金或金和碳。为了获得细的颗粒，有用铂或用金—钯、铂—钯合金的。金属膜的厚度一般为10nm～20nm。真空镀膜法所形成的膜，金属颗粒较粗，膜不够均匀，操作较复杂并且费时，目前已经较少使用。
2．离子溅射镀膜法
在低真空(0.1～0.01乇)状态下，在阳极与阴极两个电极之间加上几百至上千伏的直流电压时，电极之间会产生辉光放电。在放电的过程中，气体分子被电离成带正电的阳离子和带负电的电子，并在电场的作用下，阳离子被加速跑向阴极，而电子被加速跑向阳极
。如果阴极用金属作为电极(常称靶极)，那么在阳离子冲击其表面时，就会将其表面的金属粒子打出，这种现象称为溅射。此时被溅射的金属粒子是中性，即不受电场的作用，而靠重力作用下落。如果将样品置于下面，被溅射的金属粒子就会落到样品表面，形
成一层金属膜，用这种方法给样品表面镀膜，称为离子溅射镀膜法，图15(3显示该法的原理。
图15(3 离子溅射镀膜法原理图
和真空镀膜法比较，离子溅射镀膜法具有以下优点：(1)由于从阴极上飞溅出来的金属粒子的方向是不一致的，因而金属粒子能够进入到样品表面的缝隙和凹陷处，使样品表面均匀地镀上一层金属膜，对于表面凹凸不平的样品，也能形成很好的金属膜，且颗粒较
细。(2)受辐射热影响较小，对样品的损伤小。(3)消耗金属少。(4)所需真空度低，节省时间。
(二) 组织导电法
用金属镀膜法使样品表面导电，需要特殊的设备，操作比较复杂，同时对样品有一定程度的损伤。为了克服这些不足，有人采用组织导电法(又称导电染色法)，即利用某些金属 溶液对生物样品中的蛋白质?脂类和醣类等成分的结合作用，使样品表面离子化或产生导电性能好的金属盐类化合物，从而提高样品耐受电子束轰击的能力和导电率。
此法的基本处理过程是将经过固定、清洗的样品，用特殊的试剂处理后即可观察。由于不经过金属镀膜，所以不仅能节省时间，而且可以提高分辨率，还具有坚韧组织，加强固定效果的作用。
组织导电法主要有碘化钾导电染色法、碘化钾--醋酸铅导电法、丹宁酸—锇酸导电法等。比较常用的是丹宁酸—锇酸导电法，其具体操作方法如下：
(1)．样品处理：按常规方法取材、清洗及用戊二醛固定。
(2)．导电染色：将样品放入2%～4%丹宁酸溶液中浸泡。如果观察表面结构，浸泡时间为30分钟；如果观察内部结构，浸泡时间为8小时，即可过夜。在浸泡过程中，可更换一次溶液。
(3)．清洗及再固定：用磷酸缓冲液充分清洗，然后放入1%锇酸中固定2～4小时，再用磷酸缓冲液清洗。
(4)．脱水和干燥：按常规方法。
(5)．扫描电镜观察。
四．几种特殊的样品制备技术
(一) 细胞内部结构冷冻割断法
1972年，日本学者田中敬一采用冷冻树脂割断法将细胞打开，用扫描电镜观察细胞的内部结构。后来他又以二甲基亚砜代替树脂进行冷冻割断取得成功，该方法简便，结构清晰，已得到广泛应用。其操作方法如下：
1．取材和固定：为了使细胞结构清晰，不被过多的血细胞污染，可在取材前用灌注法冲洗。即先将动物麻醉，经腹主动脉注入生理盐水或低分子量的右,切开下腔静脉放血，至无血色为止。然后迅速取材，将样品修成1mm×1mm×5mm大小，投入1%锇酸溶液中固定1小时，用1/15M磷酸缓冲液 (pH7.4)清洗两次，每次10分钟。
2．二甲基亚 浸泡：将样品依次放入25%、50%二甲基亚砜溶液中，各浸泡30分钟。
3．割断：用TF—1型冷冻割断装置进行割断。然后将割断后的样品放到50%二甲基亚砜中，等融化后再用1/15M磷酸缓冲液浸洗，每次10分钟，换液5次。
4．软化及后固定：将样品放入0.1%锇酸中软化，温度20(C，时间48～72小时。然后用1% 八 固定1小时，双蒸水浸洗1小时，换液几次，需彻底清洗干净。
5．导电染色：将样品放入2%丹宁酸中2小时(或过夜)，以双蒸水清洗1小时，换液几次。再以1% 八 固定30～60分钟，双蒸水清洗1小时。
6．脱水、干燥及镀膜：按常规方法进行。
(二) 铸型技术
为了研究空腔脏器特别是血管系统复杂的立体分布，先向腔内注射某种成形物质，待该物硬化后再把组织腐蚀去掉，剩下的成形物即能显示血管系统的立体分布，这种技术称铸型技术。如果是研究血管系统，称为血管铸型。用铸型技术制作的标本，经过镀膜后，就可进行扫描电镜观察。
常用的铸型剂有甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯及其共聚物以及ABS等。ABS是一种树脂，为丙烯晴、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物，被认为是比较理想的铸型剂。下面简单介绍用ABS制作血管铸型标本的方法：
1．灌流和注入铸型剂
首先将准备灌注的器官取下或保持自然位置，找到动脉，插入玻璃管或静脉穿刺针，并以粗丝线结扎之，用普通流水或温盐水将血管中的血液冲洗干净。然后灌注铸型剂ABS丁酮溶液，浓度为5%～30%，注入的压力为100mmHg。注入铸型剂的脏器，可以放在50(C～60(C 的温水中浸泡6小时左右，这样既能保持脏器的原形，也有助于铸型剂的硬化。
2．腐蚀和清洗
将标本放入10%～20%氢氧化钠或氢氧化钾溶液中腐蚀，也有放20%～30%盐酸中腐蚀。时间一般为5～7天。若用稀盐酸腐蚀，可加入5%～10%胃蛋白酶，腐蚀的效果更好。然后用流水将血管铸型周围被腐蚀的组织冲洗干净，时间为24～72小时，冲洗的速度要慢。
3．显微解剖和剥制铸型
为了暴露和切取要观察的部分，需要在解剖显微镜下进行。如果铸型太硬，可将铸型浸入酒精中，加温至40～60(C，能使铸型变软，便于解剖和切取。
4．干燥和镀膜
将切取的铸型用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干后放37(C温箱中30～60分钟，最后放干燥缸中保存。镀膜可用真空喷镀，也可用离子镀膜，方法同前。镀膜后就可用扫描电镜观察
。
(三) 盐酸化学消化法
为了研究被观察细胞的基底面及深层细胞表面，可采用盐酸化学消化法制备样品。
1．固定和清洗：同常规方法。
2．盐酸消化：用8mol/L盐酸消化和腐蚀，其温度与时间根据不同组织而异。
3．清洁样品：用2%～5%Tween20作用3小时，以清洁样品和稳定其结构。
4．脱水、干燥和镀膜：按常规方法处理。
5、使用什么显微镜可以观察细菌的生物膜
细胞膜用光学显微镜就可以，但要观察有些细胞器乃至细胞器膜就得用电子显微镜。生物膜是细胞膜+细胞器膜
6、电镜下观察的生物膜结构可见 选项: a、两层深色致密层和中间一层浅色疏松层 b、两层深色疏松层和中间一层
a。两层致密的是磷脂分子层，因为是两层磷脂分子，所以两层致密的；中间饿浅色疏松层是两层磷脂分子之间的物质。
7、在电子显微镜下观察细胞膜，可以看到的是两条暗带中间夹一条明带，那么对这两条暗带和一条明带的化学成分
答案是：D 。
1959年罗伯特森看到的暗—亮—暗的现象，其实是两层磷脂分子层（暗）和中间的一层，而中间的一导中主要是蛋白质，两条暗带的成分虽然主要是磷脂，但是还是有蛋白质。
8、激光共聚焦显微镜怎么观察生物膜
荧光显微镜和激光共聚焦显微镜的区别
激光共聚焦显微镜是采用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图象处理的一套观察、分析和输出系统。主要系统包括激光光源、自动显微镜、扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜、检测器）、数字信号处理器、计算机以及图象输出设备（显示器、彩色打印机）等。通过激光扫描共聚焦显微镜，可以对观察样品进行断层扫描和成像。因此，可以无损伤的观察和分析细胞的三维空间结构。
同时，通过激光扫描共聚焦显微镜也是活细胞的动态观察、多重免疫荧光标记和离子荧光标记观察的有力工具.精确地对光谱的本质进行分析，区分发射光谱高度重叠的不同标记的信号。
最重要的是，对于多色的荧光染色，它能彻底消除了荧光串色的影响，同时最大限度的减少了样品荧光信号的损失。这些都是一般光镜所不能达到的。
9、我想问问如何判断生物膜挂膜成功？？
1.调试成功通过直接观察生物膜形成状态可以判断。2.微生物观察是一个辅佐的参考。3.显微镜观察，生物膜应该以放线状的菌丝体及活性泥团为底膜。并夹有多量原生动物及后生动物，提示生物膜已进入正常微生物环境的代谢状态。4.培养初期的生物膜会夹有多量细小的非活性污泥类原生动物，罕见后生动物。非活性污泥类原生动物以滴虫、侧跳虫、小轮甲虫为主。5.正常阶段生物，以匍匐类原生动物及附着类原生动物为主，并可见多量后生动物。
10、用什么样的显微镜可以看到细胞膜
细胞膜属于细胞内的生物膜，也是细胞的基本结构，如果只是要看到细胞膜，用普通的光学显微镜就能看到；如果要想看到细胞膜的精细结构，就必须使用电子显微镜才能观察到。