vps34

1、细胞自噬的揭示机制

加州大学圣地亚哥分校的管坤良教授领导的一支研究团队揭示了调控细胞自噬的一个关键分子机制，研究人员发现，AMPK酶，不仅参与了细胞的传感和能量调控，而且在细胞自噬酶作用方面，也扮演了重要角色。细胞自噬是细胞在恶劣条件下确保其生存的基本应激反应。
研究人员发现，AMPK能以不同的方式，调控一种称为Vps34激酶家族不同的复合物，一些Vps34酶参与了正常细胞的囊泡运输——细胞中一种重要的分子运输，还有一些Vps34复合物则参与了细胞自噬。管教授与其同事们发现，AMPK能抑制那些未参与细胞自噬的酶，而激活参与细胞自噬的Vps34酶。

2、PI3K抑制剂Buparlisib (BKM120)要去哪儿买啊？

BKM120 (NVP-BKM120, Buparlisib) 是一种选择性 PI3K 抑制剂，在无细胞试验中作用于p110α/β/δ/γ的IC50分别为 52 nM/166 nM/116 nM/262 nM。对 VPS34，mTOR，DNAPK 的作用效果下降，而对 PI4Kβ几乎没有活性。

我们实验室一般用Sigma 和 Sellsck。sigma老牌子，贵。Selleck性价比更高。

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3、自噬的自噬的研究方法

正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：
（一）自噬诱导剂
1）Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激
2）Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）
3）Earle's平衡盐溶液：制造饥饿
4）N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂
5）Rapamycin：mTOR抑制剂 (最常用)
6）Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂
（二）自噬抑制剂
1）3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂
2）Bafilomycin A1：质子泵抑制剂
3）Hydroxychloroquine（羟氯喹）
除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。
（三）自噬检测方法：
细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：
1）Western Blot检测LC3的切割
利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成。自噬形成时，胞浆型LC3会酶解掉一小段多肽形成LC3-I，LC3-I跟PE结合转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。

2）在荧光显微镜下采用GFP-LC3单荧光体系/mRFP-GFP-LC3双荧光体系等融合蛋白来示踪自噬形成：
GFP-LC3 单荧光自噬指示体系：
利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的原理，开发出GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。但是绿色斑点增多并不一定代表自噬活性增强，也有可能是自噬溶酶体降解途径受阻，可以通过western blot 检测游离的GFP、p62来验证。
另一种方法是利用mRFP-GFP-LC3 。
mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系：
由于分子生物学的发展，现在已经诞生了mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系，用于标记及追踪LC3以及自噬流的变化。其中GFP是酸敏感型GFP蛋白，而mRFP是稳定的荧光表达基团，不受外界影响。由于自噬小体进入第二阶段后，与溶酶体进行融合，形成自噬溶酶体。自噬溶酶体由于溶酶体内部的酸性环境，可以导致PH下降，GFP淬灭，因此，GFP的减弱可指示自噬溶酶体形成的顺利程度，GFP越少，则从自噬小体到自噬溶酶体阶段流通得越顺畅。反之，自噬小体和溶酶体融合被抑制，自噬溶酶体进程受阻。mRFP是一直稳定表达的，因而可以通过GFP与mRFP的亮点比例来评价自噬流进程。

mRFP-GFP-LC3 双荧光自噬指示体系的出现，把自噬研究带入了一个新的阶段，自噬不再只是指标，而是一种机制，自噬流的顺畅与否，对于细胞生理功能的稳定非常关键。

3）透射电镜下观察自噬体的形成：
自噬经历了：吞噬泡(phagophore)--自噬小体(autophagosome)--自噬溶酶体(autolysosome)
透射电镜下吞噬泡(phagophore)的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬小体(autophagosome)的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(autolysosome)的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。

4、Beclin 1什么意思?

Beclin-1 is a protein that in humans is encoded by the BECN1 gene.[1][2]

Beclin-1 is also known as autophagy-related gene (Atg) 6. Beclin-1 and its binding partner class III phosphoinositide 3-kinase (PI3K), also named Vps34, are required for the initiation of the formation of the autophagasome in autophagy.
Beclin-1是一种人体内的蛋白，它是又BECN1基因所编码的。
同样，也是与自溶相关的基因。Beclin-1和它的结合物，第三类磷酸肌醇3激酶，同样也叫Vps34，在自我吞噬过程中形成吞噬小体的起始有关。

5、选择性p110δ抑制剂Idelalisib作用机制是什么？

CAL-101 (Idelalisib, GS-1101) 是选择性p110δ抑制剂，在无细胞试验中IC50为 2.5 nM；对 p110δ 表现出的选择性是对 p110α/β/γ 的 40 到 300 倍，对p110δ的选择性是对 C2β，hVPS34，DNA-PK 和 mTOR的400到4000倍。

CAL-101 对p110α, p110β,和p110γ作用效果不大。CAL-101作用于原代嗜碱细胞特定阻断FcϵR1 p110δ调节的 CD63表达，EC50 为8 nM。与急性髓性白血病(AML) 和骨髓增生性肿瘤(MPN) 细胞相比，CAL-101 作用于B-cell急性淋巴细胞白血病(B-ALL)和慢性淋巴细胞白血病(CLL) 细胞时显示更强的活性。CAL-101 作用于SU-DHL-5, KARPAS-422 和CCRF-SB细胞，降低pAktS473, pAktT308, 和下游靶点S6， EC50为0.1到1.0 μM。 [1] CAL-101 作用于CLL细胞，诱导选择性细胞毒性，不是通过突变状态或间期细胞遗传学,主要通过caspase依赖机制。与正常B细胞相比，CAL-101作用于CLL 细胞优先产生细胞毒性，和LY294002相比，作用于其他造血细胞不会产生毒性。CAL-101 作用于T 细胞和天然杀伤细胞 缺乏直接的细胞毒性潜能。CAL-101抑制炎症细胞因子的产生,比如 IL-6, IL-10, TNF-α,和IFN-γ,且激活诱导的细胞因子,如CD40L。CAL-101 也抗CD40L调节的CLL细胞存活。[2] CAL-101 作用于L1236和L591细胞, 诱导细胞在G1期积累，在S期下降，说明 CAL-101可以作为治疗霍杰金淋巴瘤(HL)的一种新策略。

参考链接：http://www.selleck.cn/procts/CAL-101.html

6、PI3K抑制剂3-MA的配制以及使用说明？

3-Methyladenine是一种选择性PI3K抑制剂，作用于Vps34和PI3Kγ，IC50分别为25 μM和60 μM；永久抑制I型PI3K，但对III型PI3K的抑制是短暂的，也抑制自噬体的形成。
体内研究：3-Methyladenine (3-MA)可以通过对磷酸肌醇3磷酸激酶(PI3K) 的作用来阻断自吞噬, 而PI3K的活性对于自噬体形成早期膜池的成核和组装是必须的。与SAH 处理组相比3-MA并不会改变出血的程度。与SAH +对照成分组相比经过3-MA预处理后会明显加重神经病学症状。3-MA处理会减少自吞噬发生。 相反地,在SAH + 3-MA组里 断裂的半胱天冬酶表达量明显上调，与此一致的是与SAH + 对照成分组相比，SAH + 3-MA组中右脑皮层里原位末端标记阳性细胞数量明显增多。