grna靶位點設計網站

1、sgrna是 靶標基因序列 上的一段嗎

基因解碼，也就是基因檢測後的信息解讀工作，將是即互聯網信息後另一個正在來斷被開發的新領域。其應用價值不可估量。佳學基因可以幫助你回答的

2、:要將目的基因最終克隆到表達載體當中,目的基因靠近ATG的末端需要加哪種限制

怎麼才能設計出好的sgRNA呢？既要考慮切割效率，也要考慮特異性。

切割效率
靶位點的位置：

1、避免靶向基因的N端或C端：避免靶向基因的N端以減輕細胞使用起始密碼子下游的替代ATG。而避免靶向基因的C端以最大化創建非功能等位基因的機會。（因為靠近蛋白末端的片段突變不太可能幹擾基因表達）；

2、避免靶向5』和3』 UTRs區；

3、有些基因特異性的模式，如空間位阻等也會降低基因編輯效率。
特異性
截短gRNAs （trugRNAs）
crRNA序列小於20個核苷酸，可以減少脫靶位點突變多達5000倍或更多，而不犧牲靶基因組編輯效率。具有17或18個核苷酸的截短gRNA稱為「trugRNA」。
17個核苷酸是實現有效基因編輯的最小長度。
根據經驗，還是推薦大家使用18-19bp的trugRNA，有些17bp的trugRNA可能不起作用。（可能的原因是：20bp的gRNA對其靶位點具有比所需更多的親和力，因此18-19bp的trugRNA也會起作用，而且trugRNA可能使tru-RGN/DNA復合物對錯配更敏感。）trugRNA可以有效地在人類細胞中引入靶向插入缺失（indel）或HDR介導的基因組編輯事件。

3、crispr系統中sgrna和grna一樣嗎

sgrna是single guide RNA（單導向RNA）的縮寫。在CRISPR/Cas9系統中sgRNA與gRNA是一個概念。

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是原核生物基因組內的一段重復序列，是生命進化歷史上，細菌和病毒進行斗爭產生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合到細菌，利用細菌的細胞工具為自己的基因復制服務。

細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出CRISPR-Cas9系統，利用這個系統，細菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的基因組上切除，這是細菌特有的免疫系統。

擴展知識：

功能特點：

CRISPR是生物科學領域的游戲規則改變者，這種突破性的技術通過一種名叫Cas9的特殊編程的酶發現、切除並取代DNA的特定部分。這種技術的影響極其深遠，從改變老鼠皮毛的顏色到設計不傳播瘧疾的蚊子和抗蟲害作物，再到修正鐮狀細胞性貧血等各類遺傳疾病等等。

該技術具有非常精準、廉價、易於使用，並且非常強大的特點。 

CRISPR來自微生物的免疫系統，這種工程編輯系統利用一種酶，能把一段作為引導工具的小RNA切入DNA，就能在此處切斷或做其他改變。以往研究表明，通過這些介入，CRISPR能使基因組更有效地產生變化或突變，效率比TALEN（轉錄激活因子類感受器核酸酶）等其他基因編輯技術更高。

雖然CRISPR有許多優點，在人類癌細胞系列中，它也可能產生大量「誤傷目標」，尤其是對不希望改變的基因做修改。

4、新手指南：如何設計CRISPR實驗進行基因組編輯

十年前，當研究人員開始解析細菌和古細菌中一個稱為 CRISPR 結構的時候，他們並沒有預料到這會給基因編輯世界帶來一場風暴。在過去的這一年半時間里，CRISPR 方法已迅速席捲了整個動物王國，成為 DNA 突變和編輯的一種「馬上」技術——迄今為止在幾乎每種實驗細胞類型中都能起作用，包括人類細胞，小鼠，斑馬魚和果蠅細胞；這種技術也易於操作，已經有兩個研究組利用 CRISPR 分析了人類細胞中幾乎每個基因單突變（詳細報道 Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：張峰建立CRISPR/Cas9人細胞敲除體系）。就在最近，CRISPR 還幫助研究人員完成了攜帶特殊基因中斷（gene disruptions）的工程猴，這項壯舉此前曾在小鼠中實現過，但未在靈長類動物中完成過（詳細報道 Cell：中國科學家利用CRISPR/Cas9技術構建基因工程猴）。 CRISPR 本身是一種防禦系統，用以保護細菌和古細菌細胞不受病毒的侵害。在這些生物基因組中的 CRISPR 位點能表達與入侵病毒基因組序列相匹配的小分子 RNA。當微生物感染了這些病毒中的一種，CRISPR RNA 就能通過互補序列結合病毒基因組，並表達 CRISPR 相關酶，也就是 Cas，這些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。 將 CRISPR/Cas 系統用於其它非細菌細胞需要滿足兩個條件：一個 Cas 酶，用於切斷靶標 DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一個就是稱為導向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，這種分子能通過互補結合靶標。gRNA 也就是細菌細胞中 CRISPR RNA 的一個更短的版本，它能與 Cas 形成復合物，指導 Cas 到達正確的剪切位點。不過研究人員也可以通過結合其它元件，或者改變 Cas 活性，來調整這種工具在基因校正和基因調控方面的作用。 「目前，非傳統基因編輯應用方面的生物學家利用一種新工具，分析細胞中，和整個生物機體中突變的作用」，來自加州大學伯克利分校的生物化學教授Jennifer Doudna 表示，她與她的同事解析了細菌細胞中 CRISPR 的作用機制。近期，Doudna 研究組利用這種工具，首次通過小鼠受精卵基因編輯構建了敲除小鼠。 不過 CRISPR 技術也存在一個主要的缺點，那就是缺乏特異性：一些 gRNA 分子結合的 DNA 只是部分與 gRN 互補。在這一方面，其它基因編輯方法，如鋅指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更為具有優勢，因為這兩者需要識別更長的靶標 DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和細胞表達方面要比 gRNA 難得多，而且研究人員通常還需要驗證十幾個不同的 TALENS，以及幾十個不同的 ZFNs，來證明其中一個有效。 近期《科學家》（The Scientist）雜志匯總了基因編輯過程中 Cas 和 gRNA 的處理過程及解決方案，用於幫助新接觸這一技術的研究人員熟悉這項熱門技術。 如何 CRISPR 我的靶標？由於 CRISPR 系統並不復雜，因此我們所要做的就是將帶有質粒（能表達 Cas 和 gRNA）的細胞進行轉染。研究人員可以採用一種 Cas 的變體，即 Cas9，這種酶來自於一種鏈球菌，由 RNA 進行指引，能無需其他蛋白的幫助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切斷與 gRNA 結合的 DNA 鏈，也能切斷其互補鏈。目前可以從 Addgene 購買 Cas9 質粒（65 美元），將其直接轉染入細胞。

5、設計gRNA時為什麼AT值要高一點

gRNA又稱引導RNA，真核生物中參與RNA編輯的具有與mRNA互補序列的RNA. gRNA分子是能通過正常的鹼基配對途徑，或通過G—U配對方式與mRNA上的互補序列配對，編輯前的mRNA分子中刪除了一個腺嘌呤核苷酸(A)，由gRNA和mRNA形成了一個雜合分子，增加了A·U和U·G鹼基對。被刪除的A又重新插入雜合分子中的mRNA部分。通過這樣編輯後的mRNA分子，比原來的mRNA分子增加了二個U。在翻譯成蛋白質時就相當於發生了移碼突因。

6、張峰 sgrna設計網站怎麼進不去了

我猜你和我一樣，保存的是他們上層網址，然後自己點幾次才能進入sgRNA的設計界面。
貌似他們把網址改掉了，或是鏈接bug了。
你用下面這個鏈接，可以直接進入sgRNA的設計界面：
http://crispr.mit.e/
親測有效

7、如何提高sgRNA的打靶效率

為進一步提高CRISPR/Cas9系統的打靶效率，比較共質粒或雙質粒表達Cas9內切酶和小向導RNA （sgRNA）的不同載體設計對其打靶效率的影響。方法：將針對AAVS1位點的2個sgRNA序列分別插入表達Cas9的質粒pSpCas9上，再將其構建為Cas9-sgRNA二合一的共質粒以及獨立表達sgRNA和Cas9的雙質粒系統；質粒轉染293T細胞後，用T7E1酶切方法檢測打靶效率。結果：不經過變性退火的PCR片段也能直接進行T7E1酶切；Cas9-sgRNA共質粒系統的打靶效率顯著高於雙質粒系統。

8、CRISPR/Case9實驗的gRNA怎麼設計和構建，求教

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