crisprgrna設計網站

1、如何設計我的CRISPR/Cas實驗

十年前，當研究人員開始解析細菌和古細菌中一個稱為 CRISPR 結構的時候，他們並沒有預料到這會給基因編輯世界帶來一場風暴。在過去的這一年半時間里，CRISPR 方法已迅速席捲了整個動物王國，成為 DNA 突變和編輯的一種「馬上」技術——迄今為止在幾乎每種實驗細胞類型中都能起作用，包括人類細胞，小鼠，斑馬魚和果蠅細胞；這種技術也易於操作，已經有兩個研究組利用 CRISPR 分析了人類細胞中幾乎每個基因單突變（詳細報道 Science：CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：張峰建立CRISPR/Cas9人細胞敲除體系）。就在最近，CRISPR 還幫助研究人員完成了攜帶特殊基因中斷（gene disruptions）的工程猴，這項壯舉此前曾在小鼠中實現過，但未在靈長類動物中完成過（詳細報道 Cell：中國科學家利用CRISPR/Cas9技術構建基因工程猴）。

CRISPR 本身是一種防禦系統，用以保護細菌和古細菌細胞不受病毒的侵害。在這些生物基因組中的 CRISPR 位點能表達與入侵病毒基因組序列相匹配的小分子 RNA。當微生物感染了這些病毒中的一種，CRISPR RNA 就能通過互補序列結合病毒基因組，並表達 CRISPR 相關酶，也就是 Cas，這些酶都是核酸酶，能切割病毒 DNA，阻止病毒完成其功能。

將 CRISPR/Cas 系統用於其它非細菌細胞需要滿足兩個條件：一個 Cas 酶，用於切斷靶標 DNA，比如目的基因中的 DNA 片段，另外一個就是稱為導向 RNA （gRNA）的 RNA 分子，這種分子能通過互補結合靶標。gRNA 也就是細菌細胞中 CRISPR RNA 的一個更短的版本，它能與 Cas 形成復合物，指導 Cas 到達正確的剪切位點。不過研究人員也可以通過結合其它元件，或者改變 Cas 活性，來調整這種工具在基因校正和基因調控方面的作用。

「目前，非傳統基因編輯應用方面的生物學家利用一種新工具，分析細胞中，和整個生物機體中突變的作用」，來自加州大學伯克利分校的生物化學教授Jennifer Doudna 表示，她與她的同事解析了細菌細胞中 CRISPR 的作用機制。近期，Doudna 研究組利用這種工具，首次通過小鼠受精卵基因編輯構建了敲除小鼠。

不過 CRISPR 技術也存在一個主要的缺點，那就是缺乏特異性：一些 gRNA 分子結合的 DNA 只是部分與 gRN 互補。在這一方面，其它基因編輯方法，如鋅指核酸酶（ZFN）和 TALENS 可能要比 Cas - gRNA 更為具有優勢，因為這兩者需要識別更長的靶標 DNA 序列。但是 ZFN 和 TALENS 方法在克隆和細胞表達方面要比 gRNA 難得多，而且研究人員通常還需要驗證十幾個不同的 TALENS，以及幾十個不同的 ZFNs，來證明其中一個有效。

近期《科學家》（The Scientist）雜志匯總了基因編輯過程中 Cas 和 gRNA 的處理過程及解決方案，用於幫助新接觸這一技術的研究人員熟悉這項熱門技術。

如何 CRISPR 我的靶標？
由於 CRISPR 系統並不復雜，因此我們所要做的就是將帶有質粒（能表達 Cas 和 gRNA）的細胞進行轉染。研究人員可以採用一種 Cas 的變體，即 Cas9，這種酶來自於一種鏈球菌，由 RNA 進行指引，能無需其他蛋白的幫助而切割 DNA （Science, 337:816-21, 2012）。Cas9 既能切斷與 gRNA 結合的 DNA 鏈，也能切斷其互補鏈。目前可以從 Addgene 購買 Cas9 質粒（65 美元），將其直接轉染入細胞。

2、crispr系統中sgrna和grna一樣嗎

sgrna是single guide RNA（單導向RNA）的縮寫。在CRISPR/Cas9系統中sgRNA與gRNA是一個概念。

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是原核生物基因組內的一段重復序列，是生命進化歷史上，細菌和病毒進行斗爭產生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合到細菌，利用細菌的細胞工具為自己的基因復制服務。

細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出CRISPR-Cas9系統，利用這個系統，細菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的基因組上切除，這是細菌特有的免疫系統。

擴展知識：

功能特點：

CRISPR是生物科學領域的游戲規則改變者，這種突破性的技術通過一種名叫Cas9的特殊編程的酶發現、切除並取代DNA的特定部分。這種技術的影響極其深遠，從改變老鼠皮毛的顏色到設計不傳播瘧疾的蚊子和抗蟲害作物，再到修正鐮狀細胞性貧血等各類遺傳疾病等等。

該技術具有非常精準、廉價、易於使用，並且非常強大的特點。 

CRISPR來自微生物的免疫系統，這種工程編輯系統利用一種酶，能把一段作為引導工具的小RNA切入DNA，就能在此處切斷或做其他改變。以往研究表明，通過這些介入，CRISPR能使基因組更有效地產生變化或突變，效率比TALEN（轉錄激活因子類感受器核酸酶）等其他基因編輯技術更高。

雖然CRISPR有許多優點，在人類癌細胞系列中，它也可能產生大量「誤傷目標」，尤其是對不希望改變的基因做修改。

3、張峰 sgrna設計網站怎麼進不去了

我猜你和我一樣，保存的是他們上層網址，然後自己點幾次才能進入sgRNA的設計界面。
貌似他們把網址改掉了，或是鏈接bug了。
你用下面這個鏈接，可以直接進入sgRNA的設計界面：
http://crispr.mit.e/
親測有效

4、如何利用CRISPR實現單鹼基編輯

Liu實驗室對「單鹼基編輯器」的要求十分簡單：
1. 將Cas9與胞苷脫氨酶融合
2. 在gRNA的指導下，Cas9到達指定位點
3. 目標胞嘧啶在非目標鏈的第4-8位

5、crispr/cas9 基因敲除，怎樣判斷grna活性

利用copy基因同源重組進行基因敲除

基因敲除是80年代後半期應用DNA同源重組原理發展起來的。80年代初，胚胎幹細胞(ES細胞)分離和體外培養的成功奠定了基因敲除的技術基礎。1985年，首次證實的哺乳動物細胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細胞基因敲除的小鼠模型。直到現在，運用基因同源重組進行基因敲除依然是構建基因敲除動物模型中最普遍的使用方法。

2.誘導性基因敲除也是以Cre/loxp系統為基礎，但卻是利用控制Cre表達的啟動子的活性或所表達的Cre酶活性具有可誘導的特點，通過對誘導劑給予時間的控制或利用Cre基因定位表達系統中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統轉移到動物體內的過程在時間上的可控性，從而在1oxP動物的一定發育階段和一定組織細胞中實現對特定基因進行遺傳修飾之目的的基因敲除技術。人們可以通過對誘導劑給予時間的預先設計的方式來對動物基因突變的時空特異性進行人為控制、以避免出現死胎或動物出生後不久即死亡的現象。常見的幾種誘導性類型如下：四環素誘導型；干擾素誘導型;激素誘導型;腺病毒介導型。

6、除了CRISPR，還知道哪些基因編輯技術

ZFN

ZFN，即鋅指核糖核酸酶，由一個 DNA 識別域和一個非特異性核酸內切酶構成。DNA 識別域是由一系列 Cys2-His2鋅指蛋白（zinc-fingers）串聯組成（一般 3~4 個），每個鋅指蛋白識別並結合一個特異的三聯體鹼基。鋅指蛋白源自轉錄調控因子家族（transcription factor family），在真核生物中從酵母到人類廣泛存在，形成alpha-beta-beta二級結構。其中alpha螺旋的16氨基酸殘基決定鋅指的DNA結合特異性，骨架結構保守。對決定DNA結合特異性的氨基酸引入序列的改變可以獲得新的DNA結合特異性。多個鋅指蛋白可以串聯起來形成一個鋅指蛋白組識別一段特異的鹼基序列，具有很強的特異性和可塑性，很適合用於設計ZFNs。與鋅指蛋白組相連的非特異性核酸內切酶來自FokI的C端的96個氨基酸殘基組成的DNA剪切域(Kim et al., 1996)。FokI是來自海床黃桿菌的一種限制性內切酶，只在二聚體狀態時才有酶切活性(Kim et al., 1994)，每個FokI單體與一個鋅指蛋白組相連構成一個ZFN，識別特定的位點，當兩個識別位點相距恰當的距離時（6~8 bp），兩個單體ZFN相互作用產生酶切功能。從而達到 DNA 定點剪切的目的。

TALEN

TALENs中文名是轉錄激活因子樣效應物核酸酶，TALENs是一種可靶向修飾特異DNA序列的酶，它藉助於TAL效應子一種由植物細菌分泌的天然蛋白來識別特異性DNA鹼基對。TAL效應子可被設計識別和結合所有的目的DNA序列。對TAL效應子附加一個核酸酶就生成了TALENs。TAL效應核酸酶可與DNA結合並在特異位點對DNA鏈進行切割，從而導入新的遺傳物質。相對鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言，TALEN能夠靶向更長的基因序列，而且也更容易構建。但是直到現在，人們一直都沒有一種低成本的而且公開能夠獲得的方法來快速地產生大量的TALENs。

CRISPR

CRISPR是生命進化歷史上，細菌和病毒進行斗爭產生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合到細菌，利用細菌的細胞工具為自己的基因復制服務，細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出CRISPR系統，利用這個系統，細菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的染色體上切除，這是細菌特有的免疫系統。微生物學家10年前就掌握了細菌擁有多種切除外來病毒基因的免疫功能，其中比較典型的模式是依靠一個復合物，該復合物能在一段RNA指導下，定向尋找目標DNA序列，然後將該序列進行切除。許多細菌免疫復合物都相對復雜，其中科學家掌握了對一種蛋白Cas9的操作技術，並先後對多種目標細胞DNA進行切除。以往研究表明，通過這些介入，CRISPR能使基因組更有效地產生變化或突變，效率比TALEN（轉錄激活因子類感受器核酸酶）等其他基因編輯技術更高。但最近研究發現，雖然CRISPR有許多優點，在人類癌細胞系列中，它也可能產生大量「誤傷目標」，尤其是對不希望改變的基因做修改。

三種系統的比較

那麼，可能會有人疑問了，既然如此，這三種系統的區別和聯系又是什麼呢？小編特意從有效性，特異性，載體性及其它四個方面，進行了一個小小的總結。

有效性

在不同的基因位點基因靶向性的有效性都是不同的，並且這也依賴於每種細胞的轉染的效率。因此，只能點對點的比較靶向位點，細胞系和轉染方法，這樣的比較才有意義。基於我們課題組和其他課題組的ZFN和TALENs的靶向效率的實驗，我們在細胞系水平上進行了比較，雖然他們可能與不同的突變特徵有關。Chen的課題組的最近的研究進行了大規模的體外分析，發現TALENs在使用與上下游相關的序列的時候比ZFNs顯著的具有更多的突變產生。另一個組比較了TALENs和CRISPRs在人類ESCs細胞中的情況，觀察到，通過用CRISPR更換掉TALENs，在其他方面條件相同的情況下，通過產生更多的基因突變的克隆，本質上提高了效率。最近，功能上重新編碼的TALENs（reTALENs）已經得到了發展，並且在人類的iPSCs細胞中的基因編輯的有效性相比較於CRISPR得到了提高。但是這個研究發現，CRISPR比reTALENs能夠實現7-8倍的同源重組效率，並且其一定程度的比HE更有效率，擋雨ODN捐贈者進行比較。

特異性

ZFN和TALENs都是作為二聚體發揮作用的，其特異性是由DNA綁定的區域決定的，這個區域在每個剪切位點最多可以識別36bp。然而，在在II型CRISPR系統中的Cas9是由一種RNA引導的核酸，它的特異性是由PAM和PAM上游的20個引導核苷酸決定的。這表明，3』12個鹼基的「種子序列」是最關鍵的，而剩下的8個鹼基（非種子序列）甚至PAM序列都是可以錯配的。ZFN的特異性由一種不帶偏見的全基因組分析進行，並且發現存在頻率低，但是可以檢測到的脫靶事件的發生，其可以定義為一個高度有限的一部分。已經有研究表明，TALENs有比ZFN更低的細胞毒性和脫靶效率。
基於這個研究，TALENs誘導的CCR5特異性突變在CCR5的對偶基因上發生率是17%，而在高度同源的CCR2位點上只有1%。相反，CCR5特異性的ZFN的活性在這兩個位點是相在當的，CCR5位點的突變頻率是14%，而CCR2的是12%。幾個研究也報告了，CRISPR/Cas系統在細胞毒性評價或者DSB誘導的檢測（即，H2AX免疫染色）中都沒有明顯的脫靶現象。然而，最近的研究發現，CRISPR誘導的靶向不同的人類細胞的基因出現了顯著的脫靶現象。例如，靶向CCR5的CRSIPR/Cas9系統偶到的在CCR2上的脫靶切除的突變率為5-20%，這是非常接近之前討論的CCR5靶向的ZFN誘導的突變率。三個其他的小組利用更系統的方法在人類細胞中評估了CRISPR的脫靶活性，其結果表明CRISPR可能能夠發生目標不匹配，從而在預測的脫靶位點上引入微缺失或者插入（插入缺失）。此外，靶向位點的定位和內涵能夠顯著的影響gRNA識別他們的靶向目標，而在基因組序列中的「脫靶序列」也是一樣的。已經有報告說，脫靶效應能夠通過小心的控制Cas9的mRNA的濃度來克服。此外，在基因編輯的時候使用配對的Cas9的切口酶已經表明能夠顯著的減少至少1500倍的脫靶活性。

病毒為基礎的傳遞

ZFN基因可以通過慢病毒和腺病毒進行傳遞。當前，ZFNs導入體細胞是通過共轉染兩個慢病毒載體，每個載體編碼一個功能性異源二聚體對的一個單體。相反，腺病毒，但不是基於HIV的慢病毒，載體使用與TALEN的基因的傳遞，因為TALENs的大尺寸和TALE重復序列的種應用。Cas9也是一個較大的基因，並且其酶促死的版本也可以通過慢病毒進行傳遞，雖然也盛行的Cas9的穩定的表達對於細胞的毒性依然是不清楚的。

其他方面

ZFNs和TALENs都能夠在切割時產生粘性末端，因此可以使用標簽綁定，如果具有互補突出部分的雙鏈寡聚核苷酸（dsODN）是可以進行預測的。ZFNs和TALENs都可以在捐贈的質粒的基因組中引入同一個核酸靶向位點來實現。ZFNs和TALENs通過採取同源二聚體的方式從而獲得優勢，綁定門通過設計實現了重組（Ob-LiGaRe）。這種方法在使用的質粒中倒置了兩半的核酸酶的結合位點，這是在沒有改變接頭區的方向實現的，因此通過相同的ZFN/TALEN鹼基對能夠阻止連接產物的消化。因為CRISPR產生了一個非粘性末端，直接連接會遇到挑戰。最近的文章表明，具有Cas9n的gRNAs的鹼基對能夠誘導具有徒步部分的DSBs，並且促進dsODN的高效率的NHEJ介導的插入。雖然至今還沒有出版，但是進入的轉基因大小的DNA能夠通過引入在目標質粒的CRISPR/Cas9靶向位點的具有CRISPR/Cas的基因組使用。CRISPR/Cas系統相比較於ZFNs和TALENs具有幾個優勢，例如易於構建，花費低，並且產物具有可擴展性，並且能夠用於多個靶向基因組位點。

7、CRISPR/Case9實驗的gRNA怎麼設計和構建，求教

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8、如何crispr用過的grna

近幾十年來，隨著全基因組測序技術的不斷成熟，我們在各種細菌和古細版菌（archaea）中也陸權續發現了很多成簇的、規律間隔的短迴文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，即CRISPR序列，這就是二十多年前。

9、如何利用CRISPR來開展全基因組篩選

如何進行CRISPR篩選？抄

利用CRISPR文庫來開展正向遺傳學篩選包括多個步驟。在大多數情況下，CRISPR文庫是以極低的濃度提供的。因此，第一步就是將你的文庫擴增到一定程度，足以產生慢病毒。記住，你需要使用新一代測序來檢查文庫的代表性，也就是擴增前後每個gRNA的比例。隨後，用含有CRISPR文庫的慢病毒轉導細胞，產生突變細胞的異質群體，其中每個細胞或每組細胞含有不同基因的突變。

接著，利用葯物選擇或基於熒光的細胞分選來富集突變細胞，並篩選特定表型。例如，突變細胞可用在葯物篩選中，以鑒定賦予耐葯性的基因。具體來說，我們可利用某種葯物來處理突變的細胞，並分析耐葯性群體與對照相比的gRNA分布。在這種情況下，與突變時賦予耐葯性的基因相對應的gRNA可富集起來。根據這一類型實驗的結果，可了解細胞耐受葯物的機理，有助於確定未來的治療目標。