巢式pcr引物設計網站

1、求助：巢式PCR引物設計

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2、巢式PCR中的引物怎麼設計

巢式PCR一般是有兩對引物的，一對outer引物，一對inner引物。一般建議為了方便，inner引物直版接根據目標權序列來設計引物（和普通PCR引物設計方式一樣），而outer引物則從目標序列前後兩端的序列開始設計，也就是說上下游各往前後移動一些鹼基開始設計引物。outer和inner引物的設計應含有重疊區域，重疊區域一般為10bp比較合適。如果說你手上只有目標序列，沒有目標序列前後的序列信息的話，你可以使用普通引物作為outer引物，之後再從序列內部設計一對inner引物，原則和之前也是一致的，也應含有10個鹼基左右的重疊區域。這時候，因為你的inner引物PCR後產物會少一些鹼基序列，你可以設計第三對引物，這對引物為outer和Inner引物的拼接序列，然後進行PCR，將缺失的鹼基人工補上。

3、巢式PCR的巢式PCR的步驟

第一步復：目標的DNA模板藍色的制第一對引物結合。第一對引物也可能結合到其他具有相似結合位點的片段上並擴增多種產物。但只有一種產物是目的片斷（圖中未顯示可能的多種產物）。
第二步：使用圖中紅色標記的第二套引物對第一輪PCR擴增的產物進行第二輪PCR擴增。
由於第二套引物位於第一輪PCR產物內部，而非目的片斷包含兩套引物結合位點的可能性極小，因此第二套引物不可能擴增非目的片斷。這種巢式PCR擴增確保第二輪PCR產物幾乎或者完全沒有引物配對特異性不強造成的非特異性擴增的污染。

4、巢式pcr 怎麼做

簡單吶,主要是設計引物,分為外套引物和內套引物你可以設計單邊巢式或者雙邊巢式的版引物,如果權內套引物為1和2的話,外套可以設計3和4,或者設計3和1配,或者設計3和2配.
打個比方,比如你要擴增的目的基因在第200bp～400bp,內套的引物分別在200bp處（引物1）和400bp（引物2）處.
外套引物可以設計在100bp處（引物3）和600bp（引物4）處（位置看情況自己選,要在200bp前面和400bp後面）.
或者外套引物也可以設計成100bp處（引物3）,然後和400bp處（引物2）的引物配對作為外套引物（引物3,引物2）

5、什麼叫巢式PCR

就是多重PCR,第一次獲得產物濃度不夠,但循環數過多會造成產物質量不好,就會以第一次PCR產物為模板,設計內引物進行第二次擴增,獲得高質量產物

6、巢式pcr如何設計引物，巢式pcr怎麼做巢式pcr怎麼做簡單吶，主要

巢式PCR一般是有兩對引物的，一對outer引物，一對inner引物。一般建議為了方便，inner引物版直權接根據目標序列來設計引物(和普通PCR引物設計方式一樣)，而outer引物則從目標序列前後兩端的序列開始設計，也就是說上下游各往前後移動一些鹼基開始設計引物。outer和inner引物的設計應含有重疊區域，重疊區域一般為10bp比較合適。如果說你手上只有目標序列，沒有目標序列前後的序列信息的話，你可以使用普通引物作為outer引物，之後再從序列內部設計一對inner引物，原則和之前也是一致的，也應含有10個鹼基左右的重疊區域。這時候，因為你的inner引物PCR後產物會少一些鹼基序列，你可以設計第三對引物，這對引物為outer和Inner引物的拼接序列，然後進行PCR，將缺失的鹼基人工補上。

7、巢式PCR的原理

PCR原理〕
DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據鹼基互補配對原則復製成同樣的兩分子挎貝。在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，並設計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。
但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。
發現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對於PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，並逐步應用於臨床。
PCR技術的基本原理 類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

8、如何設計巢氏PCR的第一對引物

可以使用primer5 或者primerdesign設計 還是主要考慮發夾結構，GC含量，Tm值和引物交叉，還有減少引物二版聚體的產生。
如果是擴增啟動子權的話，建議選擇引物的長度30-35bp，一般試劑盒裡有接頭引物的，只要在下游已知序列設計引物就可以咯

9、巢式PCR中的引物怎麼設計

巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(PCR)，使用兩對（而非一對版）PCR引物擴增權完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內部）結合在第一次PCR產物內部，使得第二次PCR擴增片段短於第一次擴增。巢式PCR的好處在於，如果第一次擴增產生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對並擴增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異。

10、pcr的技術的主要步驟及pcr引物設計的一般原則有哪些

PCR的技術的主要步驟及PCR引物設計的一般原則分述如下：

PCR的技術的主要步驟：

1、DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

2、退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。

2、引物設計的基本原則

1、引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

3、引物內部不應出現互補序列。

4、兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。

5、引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個鹼基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。

6、引物3『端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。

7、引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

(10)巢式pcr引物設計網站擴展資料

PCR技術的基本原理 類似於DNA的 天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

PCR是一種體外DNA 擴增技術，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴於DNA聚合酶的酶促合反應，將待擴增的DNA片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經「高溫變性——低溫退火——引物延伸」三步反應的多次循環，使DNA片段在數量上呈指數增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。

在環境檢測中，靶核酸序列往往存在於—個復雜的混合物如細胞提取液中，且含量很低，對於探測這種復雜群體中的特異微生物或某個基因，雜交就顯得不敏感。使用PCR技術可將靶序列放大幾個數量級，再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結構。PCR技術常與其他技術結合起來使用， 如RT-PCR、競爭PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。

第一代PCR就是常見的定性PCR技術，它採用普通PCR儀來對靶基因進行擴增，採用瓊脂糖凝膠電泳來對產物進行分析。第二代PCR就是熒光定量PCR技術（Real-Time PCR，qPCR），它通過在反應體系中加入能指示反應進程的熒光試劑來實時監測擴增產物的積累，藉助熒光曲線的Cq值來定量起始靶基因的濃度。

第三代PCR技術--數字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一種全新的對核酸進行檢測和定量的方法。它採用直接計數目標分子而不再依賴任何校準物或外標，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目。

PCR晶元技術PCR儀器發展的趨勢之一變得更加微型化，PCR晶元就是在這種趨勢下誕生的。PCR晶元就是在微型的載體上進行PCR反應，是微型化的PCR儀。晶元PCR不僅節省了大量反應試劑因此降低了實驗成本，還有助於提高反應速度。