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1、什麼是OneShine64CRISPR/Cas9細胞文庫

OneShine64CRISPR/CAS9細胞文庫是CRISPR/CAS9基因敲除細胞文庫的一種，是將gRNA與CAS9蛋白結合於同一個載體上，然後把設計合成回12萬個RNA（靶向約2萬個基答因），分別連接到lenti-CRISPR V2載體上，再把12萬個質粒混合起來，形成的CRISPR/CAS9基因敲除質粒文庫。文庫整合到了細胞中，對基因進行大批量的敲除。一個125cm²細胞培養基中約含有10^8個細胞，每個細胞被敲除一個基因，共約2萬個基因被敲除。這種細胞還能進行傳代。總而言之，就是CRISPR/CAS9基因敲除細胞文庫。

2、如何利用cas9製作基因編輯動物

Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9是細菌和古細菌一種copy不斷進化適應的免疫防禦機制。CRISPR/Cas9利用一段小 RNA 來識別並進行有效的靶向DNA剪切。主要分為兩個組成部分Cas9核酸酶和gRNA 兩部分。

3、crispr/cas9 基因敲除，怎樣判斷grna活性

利用copy基因同源重組進行基因敲除

基因敲除是80年代後半期應用DNA同源重組原理發展起來的。80年代初，胚胎幹細胞(ES細胞)分離和體外培養的成功奠定了基因敲除的技術基礎。1985年，首次證實的哺乳動物細胞中同源重組的存在奠定了基因敲除的理論基礎。到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES細胞基因敲除的小鼠模型。直到現在，運用基因同源重組進行基因敲除依然是構建基因敲除動物模型中最普遍的使用方法。

2.誘導性基因敲除也是以Cre/loxp系統為基礎，但卻是利用控制Cre表達的啟動子的活性或所表達的Cre酶活性具有可誘導的特點，通過對誘導劑給予時間的控制或利用Cre基因定位表達系統中載體的宿主細胞特異性和將該表達系統轉移到動物體內的過程在時間上的可控性，從而在1oxP動物的一定發育階段和一定組織細胞中實現對特定基因進行遺傳修飾之目的的基因敲除技術。人們可以通過對誘導劑給予時間的預先設計的方式來對動物基因突變的時空特異性進行人為控制、以避免出現死胎或動物出生後不久即死亡的現象。常見的幾種誘導性類型如下：四環素誘導型；干擾素誘導型;激素誘導型;腺病毒介導型。

4、crispr系統中sgrna和grna一樣嗎

sgrna是single guide RNA（單導向RNA）的縮寫。在CRISPR/Cas9系統中sgRNA與gRNA是一個概念。

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是原核生物基因組內的一段重復序列，是生命進化歷史上，細菌和病毒進行斗爭產生的免疫武器，簡單說就是病毒能把自己的基因整合到細菌，利用細菌的細胞工具為自己的基因復制服務。

細菌為了將病毒的外來入侵基因清除，進化出CRISPR-Cas9系統，利用這個系統，細菌可以不動聲色地把病毒基因從自己的基因組上切除，這是細菌特有的免疫系統。

擴展知識：

功能特點：

CRISPR是生物科學領域的游戲規則改變者，這種突破性的技術通過一種名叫Cas9的特殊編程的酶發現、切除並取代DNA的特定部分。這種技術的影響極其深遠，從改變老鼠皮毛的顏色到設計不傳播瘧疾的蚊子和抗蟲害作物，再到修正鐮狀細胞性貧血等各類遺傳疾病等等。

該技術具有非常精準、廉價、易於使用，並且非常強大的特點。 

CRISPR來自微生物的免疫系統，這種工程編輯系統利用一種酶，能把一段作為引導工具的小RNA切入DNA，就能在此處切斷或做其他改變。以往研究表明，通過這些介入，CRISPR能使基因組更有效地產生變化或突變，效率比TALEN（轉錄激活因子類感受器核酸酶）等其他基因編輯技術更高。

雖然CRISPR有許多優點，在人類癌細胞系列中，它也可能產生大量「誤傷目標」，尤其是對不希望改變的基因做修改。

5、CRISPR-Cas9是如何將特定的變化引入DNA序列的？

gRNA通過鹼基互補配對和目標序列結合後，會招募核酸內切酶Cas9對結合的序列進行切割，導致版DNA雙鏈斷裂，細權胞隨之利用非同源末端連接（NHEJ）和同源重組修復（HDR）對雙鏈DNA進行修復。
非同源末端連接是一種易錯易突變的修復途徑，容易導致斷裂位點插入或缺失數個鹼基，從而引起目標基因移碼突變或提前終止；
同源重組修復則需要引入外源修復模板，實現精準的基因插入和替換。

6、用cas9基因敲除不同轉錄本怎麼設計grna

這要具體分析，如果這個基因存在可變剪接，那就看這個基因是否有外顯子（版不為三的整倍數的權外顯子）是這些轉錄本里共有的，如果是就可以在這個外顯子上設計sgRNA，這樣就可以敲除掉這個外顯子和其後的外顯子（因為移碼突變導致的提前翻譯終止）。如果沒有這樣的外顯子那就只能在不同的外顯子上設計多條sgRNA，然後篩選這幾個轉錄本都敲除成功的細胞系或實驗動物就可以了（畢竟應用Cas9技術能夠實現多基因敲除）。

7、crispr dcas9怎麼同時激活和轉錄

「基因敲除狗」，「基因敲除豬」，CRISPR/Cas9到底是怎樣一個技術技術近日，中國科學家利用基因編輯技術——CRISPR/Cas9，對抑制狗骨骼肌生長的基因（MSTN）進行了敲除，培育出兩只肌肉發達的「大力神」狗，成功構建了世界首個基因敲除狗模型。科研人員所使用的「基因編輯技術」，顧名思義，能夠讓人類對目標基因進行「編輯」，實現對特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術自問世以來，就有著其它基因編輯技術無可比擬的優勢，技術不斷改進後，更被認為能夠在活細胞中最有效、最便捷地「編輯」任何基因。一、與諾獎「擦肩而過」的CRISPR/Cas9技術這不是CRISPR/Cas9這項明星技術第一次得到人們的關注。在此之前，有著「豪華版」諾獎之稱的「2015年度生命科學突破獎」頒發給了發現基因組編輯工具「CRISPR/Cas9」的兩位美女科學家——珍妮弗？杜德娜和艾曼紐？夏邦傑。二人更是獲得了2015年度化學領域的引文桂冠獎——素有諾獎「風向標」之稱，曾被認為是今年諾貝爾化學獎的最有力競爭者。那CRISPR/Cas9到底是一項什麼技術，為何能夠獲得如此這般青睞，又何以在短短兩三年時間內，發展成為生物學領域最炙手可熱的研究工具之一，並有近700篇相關論文發表？它將來又會如何影響到我們的生活？CRISPR/Cas9是繼「鋅指核酸內切酶（ZFN）」、「類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）」之後出現的第三代「基因組定點編輯技術」。與前兩代技術相比，其成本低、製作簡便、快捷高效的優點，讓它迅速風靡於世界各地的實驗室，成為科研、醫療等領域的有效工具。二、CRISPR/Cas系統的靈感來源CRISPR/Cas9技術的靈感來源於細菌的一種獲得性免疫系統。與哺乳動物的二次免疫應答類似，細菌在抵抗病毒或外源質粒入侵時，會產生相應的「記憶」，來抵抗該種外源遺傳物質的再次入侵，而這種獲得性免疫正是由細菌的CRISPR/Cas系統實現的。在細菌的基因組上，存在著串聯間隔排列的「重復序列」，這些重復序列相對保守，我們稱之為CRISPR序列（Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats—成簇的規律間隔的短迴文重復序列）。1、「記錄」入侵者檔案其中的「間隔序列」來源於病毒或外源質粒的一小段DNA，是細菌對這些外來入侵者的「記錄」。（如圖A所示）。圖1 CRISPR序列示意圖其中，菱形框表示高度可變的間隔序列，正方形表示相對保守的重復序列病毒或外源質粒上，存在「原間隔序列」，「間隔序列」正是與它們互相對應。「原間隔序列」的選取並不是隨機的，這些原間隔序列的兩端向外延伸的幾個鹼基往往都很保守，我們稱為PAM（Protospacer adjacent motifs-原間隔序列臨近基序）。當病毒或外源質粒DNA首次入侵到細菌體內時，細菌會對外源DNA潛在的PAM序列進行掃描識別，將臨近PAM的序列作為候選的「原間隔序列」，將其整合到細菌基因組上CRISPR序列中的兩個「重復序列」之間。這就是「間隔序列」產生的過程。2、打擊二次入侵者當外源質粒或病毒再次入侵宿主菌時，會誘導CRISPR序列的表達。同時，在CRISPR序列附近還有一組保守的蛋白編碼基因，稱為Cas基因。CRISPR序列的轉錄產物CRISPR RNA和Cas基因的表達產物等一起合作，通過對PAM序列的識別，以及「間隔序列」與外源DNA的鹼基互補配對，來找到外源DNA上的靶序列，並對其切割，降解外源DNA。這也就實現了對病毒或外源質粒再次入侵的免疫應答。正是基於細菌的這種後天免疫防禦機制，CRISPR/Cas9技術應運而生，從而使科學家們利用RNA引導Cas9核酸酶實現對多種細胞基因組的特定位點進行修飾。三、CRISPR/Cas9技術的實現需要什麼？在CRISPR/Cas9技術中，我們把即將被編輯的細胞基因組DNA看作病毒或外源DNA。基因編輯的實現只需要兩個工具——向導RNA（guide RNA， gRNA）和Cas9蛋白。其中，向導RNA的設計並不是隨機的，待編輯的區域附近需要存在相對保守的PAM序列（即三鹼基序列NGG，其中N可以是任意鹼基），而且向導RNA要與PAM上游的序列鹼基互補配對。以基因敲除為例，如圖3所示，在待敲除基因的上下游各設計一條向導RNA（向導RNA1，向導RNA2），將其與含有Cas9蛋白編碼基因的質粒一同轉入細胞中，向導RNA通過鹼基互補配對可以靶向PAM附近的目標序列，Cas9蛋白會使該基因上下游的DNA雙鏈斷裂。對於DNA雙鏈的斷裂這一生物事件，生物體自身存在著DNA損傷修復的應答機制，會將斷裂上下游

8、用cas9基因敲除不同轉錄本怎麼設計grna

這要抄具體分析，如果這襲個基因存在可變剪接，那就看這個基因是否有外顯子（不為三的整倍數的外顯子）是這些轉錄本里共有的，如果是就可以在這個外顯子上設計sgRNA，這樣就可以敲除掉這個外顯子和其後的外顯子（因為移碼突變導致的提前翻譯終止）。如果沒有這樣的外顯子那就只能在不同的外顯子上設計多條sgRNA，然後篩選這幾個轉錄本都敲除成功的細胞系或實驗動物就可以了（畢竟應用Cas9技術能夠實現多基因敲除）。