在線qpcr引物設計網站

1、pcr引物設計的基本原則有哪些

1、引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不能大於38bp；
2、引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；
3、引物所對應的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之間，Tm值曲線以選取72度附近為佳，5'到 3』的下降形狀也有利於引物與模板的結合；
4、ΔG值（自由能）反應了引物與模板結合的強弱程度，3'端的ΔG值相對要低，且絕對值不要超過9，否則不利於正確引發反應，3'末端雙鏈的ΔG值在0--2kcal/mol時，PCR產量幾乎達到百分之百，但在-6時只達到40%，-8時少於20%，-10時接近於0；
5、錯配率一般不要超過100，否則會出現非目的條帶。但對於某些特定的模板序列，還應結合比較其在正確位點的引發效率。如果兩者相差很大，比如在正確位點的引發效率為340以上，而在錯誤位點的引發效率為110，並且不好找到其他更合適的引物，那麼這對引物是可以接受的；
6、Frq曲線為Oligo6軟體新引進的一個指標，解釋了序列片段存在的重復幾率大小，選取引物時，應該用Frq值相對較低的片段；
7、引物二聚體及發卡結構的能量的絕對值一般不要超過4.5，否則容易產生引物二聚體而且會降低引物濃度從而導致PCR不能正常發生；
8、3'端最好不要是連續鹼基，GGG或CCC會導致錯誤的引發，同時3'端最後一個鹼基最好不要是A或T，若是，會導致錯配；
9、以公式Tm=4*（G+C）+2*（A+T）-5計算Tm值，也就是退火溫度。選擇較低Tm值的引物的退火溫度為反應的退火溫度，最好保證每個引物的Tm值相匹配，且在70-75℃范圍內；
10、模板與穩定性較小的引物之間的Tm的差異越小，PCR的效率越高。因為解鏈溫度也取決於它的長度，如果期待的產物長度等於或小於500bp，選用端的引物（16-18bp），如果產物長5kb，則用24bp的引物；
11、在DNA測序和PCR中最好用5'末端穩定（GC含量多），而3'端不穩定（AT含量多）的引物，這種引物的結構可以有效地消除假引發反應；
12、引物和產物之間的Tm值相差別太大，20攝氏度范圍內最好。
13、對引物的修飾一般在5'端進行，例如加酶切位點，加酶切位點的同時要根據需要添加保護鹼基。

2、求助檢測基因沉默的qPCR引物設計問題

引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列，一個引物與目的基因一端的一條DNA模板鏈互補，另一個引物與目的基因另一端的另一條DNA模板鏈互補。在PCR（聚合酶鏈式反應）技術中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根據這一序列合成引物，利用PCR擴增技術，目的基因DNA受熱變性後解鏈為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結合，然後在DNA聚合酶作用下進行延伸，如此重復循環，延伸後得到的產物同樣可以和引物結合。
PCR引物設計的目的是找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。如前述，引物的優劣直接關繫到PCR的特異性與成功與否。對引物的設計不可能有一種包羅萬象的規則確保PCR的成功，但遵循某些原則，則有助於引物的設計。
引物設計有 3 條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補，其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構，再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。具體實現這 3 條基本原則需要考慮到諸多因素，如引物長度（primer length），產物長度（proct length），序列 Tm 值 (melting temperature)，引物與模板形成雙鏈的內部穩定性(internal stability, 用 ∆G 值反映)，形成引物二聚體(primer dimer)及發夾結構（plexformation and hairpin）的能值，在錯配位點（false priming site）的引發效率，引物及產物的GC 含量（composition），等等。必要時還需對引物進行修飾，如增加限制性內切酶位點，引進突變等。

3、設計的qpcr引物，如何選取最佳的引物序列

擴增PCR的引物除了通用引物，如16S，18S之外，都是要自己設計的，要根據你要擴增的基因設計一對引物

4、如何用 Pubmed 設計 qPCR 引物

引物大嗎？抄 如果二十幾個bp以上的話，能查出來 正向引物不變，反向引物找反向互補序列，(就是說AATCGGATCCTCj就要翻成GAGGATCCGATT)把這兩個序列用兩個空格分開，或者用逗號隔開去blast，為了精確，應該在高級選項限制條件里選擇你要的那種生物，你要的那種基因（比如是酶就選擇酶那一類）。 然後在結果里認真找哈~~

5、怎樣用ucsc設計qpcr引物

如何得到引物序列在人類基因組上的位置信息 1. 引物的長度一般為 15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不應大於 3 2. 引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是 3』端相似性較高的序列 3. 引物 3』端的末位鹼基對 Taq 酶的 DNA 合成效率有較大的影響。

6、如何在線設計qPCR引物

?

7、普通pcr引物設計和熒光定量pcr引物設計的區別

一、方法不抄同

1、普通pcr引物設計：引物的優劣直接關繫到PCR的特異性與成功與否。

2、熒光定量pcr引物設計：通過熒光染料或熒游標記的特異性探針，標記跟蹤PCR產物進行實時監測反應，利用與之相適應的軟體對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度

二、原理不同

1、普通pcr引物設計：為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。

2、熒光定量pcr引物設計：在PCR反應體系中加入熒光基團，通過熒光信號不斷累積而實現實時監測PCR全程，然後通過標准曲線對未知模板進行定量分析的方法。在實時熒光定量PCR中，對全程PCR擴增過程進行實時檢測，根據反應時間和熒光信號的變化可以繪製成一條曲線。

三、注意事項不同

1、普通pcr引物設計：引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。產物不能形成二級結構。引物長度在15~30鹼基之間。

2、熒光定量pcr引物設計：實時熒光定量 PCR 儀應安放在濕度較低、灰塵較少、遠離水池的平穩檯面上，不能有強光直射，室內應通風良好，無腐蝕性氣體 

8、如何在線設計qPCR引物

設計引物原則
（1）引物最好在模板cDNA的保守區內設計；
（2）引物長度一般在15~30鹼基之間，過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於TaqDNA聚合酶進行反應；
（3）引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，一般計算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值；
（4）引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構使引物本身復性；
（5）引物應具有特異性。引物設計完成以後，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了；
（6）引物擴增長度：一般RT-PCR引物擴增長度在100-200bp,常規PCR擴增長度建議200-500bp。一般PCR產物達到2-3k長度也是可以的，但要考慮到可能引入突變，因此建議使用高保真的聚合酶。

9、如何快速設計多條qPCR引物

1 基因有多種變來體，該怎麼設計？
你如果源僅僅檢測這個基因的表達量，你可以將引物設計在這多種變體的保守區域內，就是所有變體都包含的區域。如果你明確要檢測哪一個變體，就設計在這個變體獨有的區域內。

2 引物blast後的產物有多種
你應該是在NCBI上進行的primer blast吧？你只要看到你的引物擴增出來的都是你要的目的基因就好了。在NCBI上有很多標記，一般認為NM的是NCBI上認可的reference的序列，NX是用戶上傳還未認證的序列，你忽略也是可以的。predicted是指用戶預測的序列，建議你還是用NCBI認證的序列。

10、如何用 Pubmed 設計 qPCR 引物

以下與大家分享 qPCR 引物設計的具體流程：
在進行引物設計之前，首先大家都應該了解引物設計需要注意的一些細節與原則，歸納如下：

引物設計原則

引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。

要設計引物首先要找到 DNA 序列的保守區。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它。如這一段不能形成二級結構，那就可以在這一區域設計引物。

產物不能形成二級結構。

引物長度一般在 15～30 鹼基之間。G＋C 含量在 40％～60％ 之間。

鹼基要隨機分布。

引物自身不能有連續 4 個鹼基的互補。引物之間不能有連續 4 個鹼基的互補。

引物 5′ 端可以修飾。引物 3′ 端不可修飾。

引物 3′ 端要避開密碼子的第 3 位。

引物所對應模板位置序列的 Tm 值在 72℃ 左右可使復性條件最佳。

Tm 值的計算有多種方法，如按公式 Tm＝4（G＋C）＋2（A＋T），在 Oligo 軟體中使用的是最鄰近法 （the nearest neighbor method）。盡可能使用兩條引物的 Tm 值相同（最好相差不要超過 5℃），退火溫度根據較低的 Tm 值選定，也可以通過改變引物的長度來平衡兩條引物的退火溫度。而對於較長的引物，Tm 值需要考慮動力學參數、從「最近鄰位」的計算方式得到，現有的 PCR 引物設計軟體大多數都採用這種方式。

對於 Tm 值的計算有爭議的地方是附加序列應不應該計算在內，我覺得有值得商討的地方。因為從理論上只有最開始的循環引物的附加序列是不與模板鏈結合的，而在後來的 PCR 反應中，引物的附加序列是和模板鏈結合了的。

ΔG 值是指 DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性。應當選用 3' 端 ΔG 值較低（絕對值不超過 9），而 5' 端和中間 ΔG 值相對較高的引物。引物的 3' 端的 ΔG 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發 DNA 聚合反應。

引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過 4.5 kcal／mol）易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使 PCR 反應不能正常進行。

引物的 3' 端要與模板嚴格配對，而 5' 端鹼基沒有嚴格的限制，只要與模板 DNA 結合的部分足夠長，其 5' 端鹼基可不與模板 DNA 配對而呈游離狀態，這樣，我們可以在引物的 5' 末端加上酶切位點（引入酶切位點時，要考慮到進行雙酶切的共用緩沖液，否則給下游工作帶來困難）、啟動子，方便下游操作。

引物設計流程

了解了設計原則，接下來我們就看看具體的設計流程，本次講解應用 pubmed 來設計。比如我們要設計小鼠源性白介素 4（IL－4） 的引物。

首先打開 pubmed， 輸入如圖，點擊搜索：

在搜索結果中選擇一個點擊進入，得到如下信息：

點擊上述界面右側的 Pick Primers。

點擊之後進入如下界面，根據上述引物設計原則裡面所述原則，填寫好相關的產物長度，引物長度，Tm 值、FASTA sequence 等信息之後，點擊 get primers。

點擊之後就能得到很多條引物序列啦，根據需要及引物設計原則選擇合適的引物序列即可。

引物設計好後，再應用 BLAST 檢驗一下。步驟如下，打開 pubmed，點擊首頁下方 BLAST。

將剛剛選擇的引物序列輸入，如圖：

點擊 blast，得到：

搜索結果中有我們剛剛查詢的 NM-021283.2，說明此序列無誤。

另外，我們還可以應用 OligoCalc 來檢測引物互補情況，點擊網址 http://biotools.nubic.northwestern.e/OligoCalc.html。進入界面輸入剛剛選擇的引物序列。

點擊 Check 即可，結果顯示 none，則為無互補情況，引物可行。