1、如何用 Pubmed 設計 qPCR 引物
以下與大家分享 qPCR 引物設計的具體流程：
在進行引物設計之前，首先大家都應該了解引物設計需要注意的一些細節與原則，歸納如下：
引物設計原則
引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。
要設計引物首先要找到 DNA 序列的保守區。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它。如這一段不能形成二級結構，那就可以在這一區域設計引物。
產物不能形成二級結構。
引物長度一般在 15～30 鹼基之間。G＋C 含量在 40％～60％ 之間。
鹼基要隨機分布。
引物自身不能有連續 4 個鹼基的互補。引物之間不能有連續 4 個鹼基的互補。
引物 5′ 端可以修飾。引物 3′ 端不可修飾。
引物 3′ 端要避開密碼子的第 3 位。
引物所對應模板位置序列的 Tm 值在 72℃ 左右可使復性條件最佳。
Tm 值的計算有多種方法，如按公式 Tm＝4（G＋C）＋2（A＋T），在 Oligo 軟體中使用的是最鄰近法 （the nearest neighbor method）。盡可能使用兩條引物的 Tm 值相同（最好相差不要超過 5℃），退火溫度根據較低的 Tm 值選定，也可以通過改變引物的長度來平衡兩條引物的退火溫度。而對於較長的引物，Tm 值需要考慮動力學參數、從「最近鄰位」的計算方式得到，現有的 PCR 引物設計軟體大多數都採用這種方式。
對於 Tm 值的計算有爭議的地方是附加序列應不應該計算在內，我覺得有值得商討的地方。因為從理論上只有最開始的循環引物的附加序列是不與模板鏈結合的，而在後來的 PCR 反應中，引物的附加序列是和模板鏈結合了的。
ΔG 值是指 DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性。應當選用 3' 端 ΔG 值較低（絕對值不超過 9），而 5' 端和中間 ΔG 值相對較高的引物。引物的 3' 端的 ΔG 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發 DNA 聚合反應。
引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過 4.5 kcal／mol）易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使 PCR 反應不能正常進行。
引物的 3' 端要與模板嚴格配對，而 5' 端鹼基沒有嚴格的限制，只要與模板 DNA 結合的部分足夠長，其 5' 端鹼基可不與模板 DNA 配對而呈游離狀態，這樣，我們可以在引物的 5' 末端加上酶切位點（引入酶切位點時，要考慮到進行雙酶切的共用緩沖液，否則給下游工作帶來困難）、啟動子，方便下游操作。
引物設計流程
了解了設計原則，接下來我們就看看具體的設計流程，本次講解應用 pubmed 來設計。比如我們要設計小鼠源性白介素 4（IL－4） 的引物。
首先打開 pubmed， 輸入如圖，點擊搜索：
在搜索結果中選擇一個點擊進入，得到如下信息：
點擊上述界面右側的 Pick Primers。
點擊之後進入如下界面，根據上述引物設計原則裡面所述原則，填寫好相關的產物長度，引物長度，Tm 值、FASTA sequence 等信息之後，點擊 get primers。
點擊之後就能得到很多條引物序列啦，根據需要及引物設計原則選擇合適的引物序列即可。
引物設計好後，再應用 BLAST 檢驗一下。步驟如下，打開 pubmed，點擊首頁下方 BLAST。
將剛剛選擇的引物序列輸入，如圖：
點擊 blast，得到：
搜索結果中有我們剛剛查詢的 NM-021283.2，說明此序列無誤。
另外，我們還可以應用 OligoCalc 來檢測引物互補情況，點擊網址 http://biotools.nubic.northwestern.e/OligoCalc.html。進入界面輸入剛剛選擇的引物序列。
點擊 Check 即可，結果顯示 none，則為無互補情況，引物可行。
2、怎麼設計realtime pcr引物
結合網上查閱的一些信息和TaKaRa使用說明書中的引物設計要求，同時結合文獻上的論述，總結出Real-time PCR 引物設計的要求及設計步驟。首先向那些以前發布信息的朋友表示感謝！因為有些是引用你們的
1.引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。最好位於編碼區5』端的300-400bp區域內，可以用DNAman, Alignment 軟體看看結果。
2.引物長度一般在17-25鹼基之間，上下游引物不能相差太大。
3.G+C含量在40%~60%之間，45-55％最佳。
4.引物序列要求：A、T、C、G整體分布盡量均勻，不能有部分AT rich，GC rich（特別是3′），避開T/C（Polypyrimidine）或者A/G（Polypurine）的連續結構。
5 避開引物內部或者兩條引物之間3個鹼基以上的互補序列，兩條引物間的3′避開有2個以上的互補序列。
6.特異性：是用BLAST檢索確認引物的特異性。
7.引物5′端可以修飾。
8.兩條引物的TM值不能相差太大。TM值的計算使用專用軟管：OLIGO：63-68度； Primer3：60-65度
9.引物3′端最好為G或者C，3′盡量避免為T。
10.引物整體設計自由能分布5『端大於3』端，且3『端自由能最好小於9KJ/mol 可用oligo 6 軟體進行比對看結果的情況。
11.做熒光定量產物長度80-150bp最好，最長是300bp.
12.引物設計避免DNA污染，最好跨外顯子接頭區。
13.引物與非特異性擴增序列的同源性最好小於70％或者有8個互補鹼基同源。
14.查看有無假基因的存在。假基因就是無功能的DNA序列，與需要擴增的目的片段長度相似。
我們的經驗是根據以上要求，使用引物設計的軟體Primer 5.0設計引物，當然不可能每一條都符合上述要求（我們構建一些載體時不是只能在編碼序列前面加上酶切位點和保護鹼基，不是別無選擇嗎？），從中選取較好的。至於能否用只有看你的運氣了。
3、普通pcr與real time pcr引物有區別嗎
普通pcr與real time pcr引物沒有區別；
熒光定量PCR，其引物和一般引物在構成上是回沒有什麼區別答的，只是要更加註意引物二聚體、PCR產物大小等問題。染料法不需要其他東西，探針法還需要taqman探針，這個探針的設計是比較有講究的，並且上面有熒光集團和猝滅基團。
聚合酶鏈式反應是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點，是能將微量的DNA大幅增加。
4、如何在線設計qPCR引物
設計引物原則
（1）引物最好在模板cDNA的保守區內設計；
（2）引物長度一般在15~30鹼基之間，過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於TaqDNA聚合酶進行反應；
（3）引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，一般計算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值；
（4）引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構使引物本身復性；
（5）引物應具有特異性。引物設計完成以後，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了；
（6）引物擴增長度：一般RT-PCR引物擴增長度在100-200bp,常規PCR擴增長度建議200-500bp。一般PCR產物達到2-3k長度也是可以的，但要考慮到可能引入突變，因此建議使用高保真的聚合酶。
5、realtime PCR引物和一般引物有何不同
如果你做的事熒光定量PCR，其引物和一般引物在構成上是沒有什麼區別的內，只是要更加註意引物二聚體、容PCR產物大小等問題。染料法不需要其他東西，探針法還需要taqman探針，這個探針的設計是比較有講究的，並且上面有熒光集團和猝滅基團。具體設計，一般使用相關軟體進行。
6、如何快速設計多條qPCR引物
1 基因有多種變來體，該怎麼設計？
你如果源僅僅檢測這個基因的表達量，你可以將引物設計在這多種變體的保守區域內，就是所有變體都包含的區域。如果你明確要檢測哪一個變體，就設計在這個變體獨有的區域內。
2 引物blast後的產物有多種
你應該是在NCBI上進行的primer blast吧？你只要看到你的引物擴增出來的都是你要的目的基因就好了。在NCBI上有很多標記，一般認為NM的是NCBI上認可的reference的序列，NX是用戶上傳還未認證的序列，你忽略也是可以的。predicted是指用戶預測的序列，建議你還是用NCBI認證的序列。
7、用什麼軟體設計real-time PCR引物
beacon disigner 專門用來設計定量PCR的軟體，而且跟primer premier 一樣，是傻瓜式操作，比較簡單
用primer premier也勉強可以設內計，就比較手動一容點了，一般70到200，盡量讓引物跨內含子，就是一個引物處在外顯子結合位點，希望對你有幫助！
8、如何設計real-time PCR 引物
你查到人類和小鼠該基因對應的mRNA序列，進行比對，找出高度同源的一段，下面就是常規的real-time PCR引物設計步驟了，你知道的吧？
9、【求助】Real-time PCR 引物設計求助
博凌科為-為你解答：1.跨越內含子主要為了避免抽提、反轉錄過程中殘留回基因組DNA污染的干擾，答因為基因組DNA是不會存在兩個外顯子連續這樣一段序列的，如果引物只在一個外顯子上就要冒這種風險2.個人感覺引物能不能工作，上下游引物的Tm值要接近，這個最重要，至於別的發卡，莖環等就要看運氣了，不行的話就再試幾個，實在不行就用老外文獻上的引物好了，記得註明參考文獻就行了。good luck