1、實時熒光定量PCR中兩種引物的設計有什麼要求
參照以下real-time PCR引物設計原則：
1.最好位於編碼區5』端的300-400bp區域內，可以用DNAman,Alignment 軟體看看結果。
2. 產物不能形成二級結構（自由能小於58.61KJ/mol）。
3.引物長度一般在17-25鹼基之間,上下游引物不能相差太大。
4.G+C含量在40%~60%之間，45-55％最佳。
5.鹼基要隨機分布，盡量均勻。
6.引物自身不能有連續4個鹼基的互補。
7.引物之間不能有連續4個鹼基的互補。
8.引物5′端可以修飾。
9. 3』端不要以A結尾，3′端不可修飾，而且要避開AT,GC rich的區域，避開T/C,A/G連續結構（2-3個）。
10. 引物3′端要避開密碼子的第3位。
11.引物整體設計自由能分布5『端大於3』端，且3『端自由能最好小於9KJ/mol。可用oligo 6 軟體進行比對看結果的情況。
12.做熒光定量產物長度80-150bp最好，最長是300bp.
13.引物設計避免DNA污染，最好跨外顯子接頭區。
14.引物與非特異性擴增序列的同源性最好小於70％或者有8個互補鹼基同源。
15.查看有無假基因的存在。假基因就是無功能的DNA序列，與需要擴增的目的片段長度相似。
16.TM值在55-63度之間。
17. .引物與非特異性擴增序列的同源性最好小於70％或者有8個互補鹼基同源。
2、設計qRT-PCR引物時，一個基因有多個變體，要選擇哪一個來設計引物才能使定量准確些？
1 基因有多種變體，該怎麼設計？
你如果僅僅檢測這個基因的表達量，你可以將引物設計在這多種變體的保守區域內，就是所有變體都包含的區域。如果你明確要檢測哪一個變體，就設計在這個變體獨有的區域內。
2 引物blast後的產物有多種
你應該是在NCBI上進行的primer blast吧？你只要看到你的引物擴增出來的都是你要的目的基因就好了。在NCBI上有很多標記，一般認為NM的是NCBI上認可的reference的序列，NX是用戶上傳還未認證的序列，你忽略也是可以的。predicted是指用戶預測的序列，建議你還是用NCBI認證的序列。
3、請教實時熒光定量PCR高手，我想做兩個物種的鼠的同一基因的相對定量並比較，請問引物設計應該注意什麼
建議你還是選擇CDS區不一樣的地方設計引物吧，這樣可以避免交叉污染引起的非特異擴增，擴增的序列長度不一定要一樣，每個引物你最好設計兩三對，然後做一個相對定量看看不同引物的擴增效率，選擇比較好的兩對引物做後續試驗，內參基因的引物不需要跟目的基因的擴增產物一樣長，這樣你設計引物的時候很受限制，總體產物長度在80-150bp之間都是可以接受的，主要是做相對定量的時候不同引物之間的擴則效率要比較接近，這樣才有可比性。
4、實時熒光定量pcr引物怎麼設計
1、查找該物種或近緣物種信息，看是否能確定內含子序列的位置，在CDS上設計跨內含子的引物，以避免基因組污染；
2、擴增片段大小最好在200bp左右，太大會影響擴增效率；
3、最好一次分別設計兩條上游（距離較近）和下游引物（距離較近），組合成4個擴增片段；
4、用任何方法或軟體設計好的引用都要用少量cDNA樣本來驗證引物擴增效果：主要是有無二聚體？有無非特異性擴增？
5、篩選出一對最滿意的引物上機，祝你實驗順利。
5、實時定量PCR引物設計
我的做法是把A基因所屬的基因家族進行blast。找出高度保守區域，設計引物
（長點，退火溫度適當高點，特異性好些），把設計好的引物進行e-pcr，看有沒有非目的擴增，如果沒有，就ok
ps：如果你開始所說的其他基因和A有同源序列，那麼他們該同類啊
6、新設計的實時定量引物在做實時定量之前需要些什麼實
a
引物長度一般在20bp左右，上下游引物鹼基長度不要相差超過4個鹼基。
b
引物退火溫度一般在58度，不同軟體TM使用不同的演算法，primer3，primer
5，primer
6，primer
express等一般可以設置在55-58度，beacon
design可以設置在65左右。
c
GC含量一般沒什麼特殊要求，40-60最好，如果不好設計，30-80也是可以的。
d
產物長度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那樣和引物二聚體不易區分，超過200bp可能會影響PCR擴增效率。
e
軟體給出的引物不能有發卡結構和超過3-4個鹼基的匹配，特別是3`端不能有鹼基匹配，那樣更容易形成二聚體。
f
引物設計好以後，在NCBI上做一個primer-blast，檢測一下是否有非特異性擴增。
7、想做實時定量PCR，怎麼找內參基因，設計內參基因的引物？
一般是查文獻，看看別人用的哪些（可以參考不同物種的，甚至擬南芥的你都可以照搬）
或自己根據基因的重要程度，選擇一些house keeping基因作為內參基因
想更精確點，將上面的基因都作為備選，不同處理下的不同樣品用多個引物對這些基因進行real time PCR，然後用geNORM這樣的軟體來評估這些基因作為內參基因的可靠性。
8、如何使用強悍的ENSEMBL和IDT設計實時定量PCR的引物
定量PCR引物設計軟體很多，NCBI Primer blast、Real time PCR primer database也很多
9、熒光定量PCR的引物如何設計。。
如果你測定的基因序列未知，可以用同源基因或者別的物種的同類基因序列來設計引物，進行PCR，看看是否能夠擴增出產物，並對產物進行確認，判斷擴增的特異性。
如果確認無誤，就可以進行熒光定量PCR。
10、熒光定量PCR引物設計
完全可以，PCR長度從50bp到數百都可以，不止局限於150-300個鹼基對。樓上說的有道理，內但是有一點要容注意，最好計算一下擴增片段的Tm值，這樣做溶解曲線的時候，光有一個峰還不夠，而且得到的TM和你計算的Tm相吻合才行。
是否在翻譯區沒有影響。