rtpcr引物設計網站

1、RTPCR的引物設計有什麼不同嗎

沒有嚴格的要求，只要考慮兩方面就行：（1）擴增的特異性；（2）擴增的高效性。所以總體要求引物不能太長，擴增產物不能太長，其他參數綜合考慮不能太差。

2、RT-pcr或者qRT-PCR引物設計是用ORF來做模板還是CDs？

qRT-PCR的引物設計使用CDS，最好擴增的片段能包含一個內含子剪切位點，這樣可以通過電泳排除擴增基因組DNA的可能性，讓定量PCR更准確

3、做RTPCR設計引物需查genebank，但是裡面哪些才是我需要的mRNA的序列呢，請高手指點

你找序列信息里，從CDS標志開始的那一段是編碼區。
查你那基因的mRNA序列，找CDS就可以了

4、如何在線設計qPCR引物

設計引物原則
（1）引物最好在模板cDNA的保守區內設計；
（2）引物長度一般在15~30鹼基之間，過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於TaqDNA聚合酶進行反應；
（3）引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。引物的Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，一般計算公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值；
（4）引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構使引物本身復性；
（5）引物應具有特異性。引物設計完成以後，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了；
（6）引物擴增長度：一般RT-PCR引物擴增長度在100-200bp,常規PCR擴增長度建議200-500bp。一般PCR產物達到2-3k長度也是可以的，但要考慮到可能引入突變，因此建議使用高保真的聚合酶。

5、如何在線設計qPCR引物

如果反轉錄體系裡面有基因組殘留，而且你的引物沒有跨內含子，這樣的情版況下就很容易造成你的ct偏小（權除了cdna擴增外，基因組的模板也會作為模板進行擴增，導致模板起始量偏高）；cdna逆轉後是切除內含子的，而基因組是存在內含子的，如果你的引物設計在了跨兩個外顯子的區域，則只能擴增cdna而不擴增基因組。
引物不跨外顯子設計也可以，但是必須保證你用的逆轉錄試劑盒裡面的gdna
wiper
可以完全去除你的基因組，你實驗的時候可以做一個nrt的對照看一下有沒有基因組污染。我做好幾個基因的引物就沒有跨外顯子設計，用的是r223
hiscript
ⅱ
q
rt
supermix
for
qpcr(+gdna
wiper)，每次nrt也沒有擴增，去除基因組效果不錯。

6、如何快速設計多條qPCR引物

1 基因有多種變來體，該怎麼設計？
你如果源僅僅檢測這個基因的表達量，你可以將引物設計在這多種變體的保守區域內，就是所有變體都包含的區域。如果你明確要檢測哪一個變體，就設計在這個變體獨有的區域內。

2 引物blast後的產物有多種
你應該是在NCBI上進行的primer blast吧？你只要看到你的引物擴增出來的都是你要的目的基因就好了。在NCBI上有很多標記，一般認為NM的是NCBI上認可的reference的序列，NX是用戶上傳還未認證的序列，你忽略也是可以的。predicted是指用戶預測的序列，建議你還是用NCBI認證的序列。

7、PCR,RT-PCR,實時熒光定量PCR的區別與聯系

1、所說的PCR應該就是最常規的PCR，以DNA為模板，通過上下游引物，實現DNA的擴增。

2、RT-PCR一般情況下是指反轉錄PCR（reverse transcription），盡管有些資料上說實時熒光定量PCR也（realtime fluores-cence quantitative PCR）也簡稱RT-PCR，但是這是不對的，不推薦。

基本操作過程是將所提取的RNA進行反轉錄，然後將所獲得的cDNA作為模板，設計引物進行擴增，是一種檢測基因表達的常用方法。

3、實時熒光定量PCR也就是Real-Time PCR，其最大的作用是檢測樣品中的初始DNA濃度。

至於三者的關系，RT-PCR和實時定量PCR應該都屬於PCR，在RNA實驗中，這二者都會應用到。

例如你要比較2個組織中的某基因的表達差異，首先你要提取2個組織的總RNA，然後通過RT-PCR檢測該基因是否在2個組織中有表達，然後通過實時定量PCR測定該基因在2個組織中的表達量是否具有顯著性差異。

(7)rtpcr引物設計網站擴展資料：

PCR原理

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據鹼基互補配對原則復製成同樣的兩分子拷貝。

在實驗中發現，DNA在高溫時也可以發生變性解鏈，當溫度降低後又可以復性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復性，加入設計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是，DNA聚合酶在高溫時會失活，因此，每次循環都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。

耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發現對於PCR的應用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環加酶，使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術得以大量應用，並逐步應用於臨床。

PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板-引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的「半保留復制鏈」，

而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

8、怎樣用ucsc設計qpcr引物

如何得到引物序列在人類基因組上的位置信息 1. 引物的長度一般為 15-30 bp，常用的是 18-27 bp，但不應大於 3 2. 引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是 3』端相似性較高的序列 3. 引物 3』端的末位鹼基對 Taq 酶的 DNA 合成效率有較大的影響。

9、做pcr，rtpcr和做克隆基因的引物有何不同

不同點來很多。最簡介自回答，是目的不同，側重點也不同：

普通pcr。只考慮能不能擴增出來就行。

rtpcr。上熒光的話，對引物質量要求高，得做個hplc或者page純化；其次對引物設計要求高，考慮得率，特異性等因素。

克隆引物。考慮加入常見酶切位點，導入何種目的載體，鹼基密碼子偏好性等。

10、如何用 Pubmed 設計 qPCR 引物

以下與大家分享 qPCR 引物設計的具體流程：
在進行引物設計之前，首先大家都應該了解引物設計需要注意的一些細節與原則，歸納如下：

引物設計原則

引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。

要設計引物首先要找到 DNA 序列的保守區。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它。如這一段不能形成二級結構，那就可以在這一區域設計引物。

產物不能形成二級結構。

引物長度一般在 15～30 鹼基之間。G＋C 含量在 40％～60％ 之間。

鹼基要隨機分布。

引物自身不能有連續 4 個鹼基的互補。引物之間不能有連續 4 個鹼基的互補。

引物 5′ 端可以修飾。引物 3′ 端不可修飾。

引物 3′ 端要避開密碼子的第 3 位。

引物所對應模板位置序列的 Tm 值在 72℃ 左右可使復性條件最佳。

Tm 值的計算有多種方法，如按公式 Tm＝4（G＋C）＋2（A＋T），在 Oligo 軟體中使用的是最鄰近法 （the nearest neighbor method）。盡可能使用兩條引物的 Tm 值相同（最好相差不要超過 5℃），退火溫度根據較低的 Tm 值選定，也可以通過改變引物的長度來平衡兩條引物的退火溫度。而對於較長的引物，Tm 值需要考慮動力學參數、從「最近鄰位」的計算方式得到，現有的 PCR 引物設計軟體大多數都採用這種方式。

對於 Tm 值的計算有爭議的地方是附加序列應不應該計算在內，我覺得有值得商討的地方。因為從理論上只有最開始的循環引物的附加序列是不與模板鏈結合的，而在後來的 PCR 反應中，引物的附加序列是和模板鏈結合了的。

ΔG 值是指 DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性。應當選用 3' 端 ΔG 值較低（絕對值不超過 9），而 5' 端和中間 ΔG 值相對較高的引物。引物的 3' 端的 ΔG 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發 DNA 聚合反應。

引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過 4.5 kcal／mol）易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使 PCR 反應不能正常進行。

引物的 3' 端要與模板嚴格配對，而 5' 端鹼基沒有嚴格的限制，只要與模板 DNA 結合的部分足夠長，其 5' 端鹼基可不與模板 DNA 配對而呈游離狀態，這樣，我們可以在引物的 5' 末端加上酶切位點（引入酶切位點時，要考慮到進行雙酶切的共用緩沖液，否則給下游工作帶來困難）、啟動子，方便下游操作。

引物設計流程

了解了設計原則，接下來我們就看看具體的設計流程，本次講解應用 pubmed 來設計。比如我們要設計小鼠源性白介素 4（IL－4） 的引物。

首先打開 pubmed， 輸入如圖，點擊搜索：

在搜索結果中選擇一個點擊進入，得到如下信息：

點擊上述界面右側的 Pick Primers。

點擊之後進入如下界面，根據上述引物設計原則裡面所述原則，填寫好相關的產物長度，引物長度，Tm 值、FASTA sequence 等信息之後，點擊 get primers。

點擊之後就能得到很多條引物序列啦，根據需要及引物設計原則選擇合適的引物序列即可。

引物設計好後，再應用 BLAST 檢驗一下。步驟如下，打開 pubmed，點擊首頁下方 BLAST。

將剛剛選擇的引物序列輸入，如圖：

點擊 blast，得到：

搜索結果中有我們剛剛查詢的 NM-021283.2，說明此序列無誤。

另外，我們還可以應用 OligoCalc 來檢測引物互補情況，點擊網址 http://biotools.nubic.northwestern.e/OligoCalc.html。進入界面輸入剛剛選擇的引物序列。

點擊 Check 即可，結果顯示 none，則為無互補情況，引物可行。