1、如何用 Pubmed 設計 qPCR 引物
以下與大家分享 qPCR 引物設計的具體流程：
在進行引物設計之前，首先大家都應該了解引物設計需要注意的一些細節與原則，歸納如下：
引物設計原則
引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。
要設計引物首先要找到 DNA 序列的保守區。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。如這個區域單鏈能形成二級結構，就要避開它。如這一段不能形成二級結構，那就可以在這一區域設計引物。
產物不能形成二級結構。
引物長度一般在 15～30 鹼基之間。G＋C 含量在 40％～60％ 之間。
鹼基要隨機分布。
引物自身不能有連續 4 個鹼基的互補。引物之間不能有連續 4 個鹼基的互補。
引物 5′ 端可以修飾。引物 3′ 端不可修飾。
引物 3′ 端要避開密碼子的第 3 位。
引物所對應模板位置序列的 Tm 值在 72℃ 左右可使復性條件最佳。
Tm 值的計算有多種方法，如按公式 Tm＝4（G＋C）＋2（A＋T），在 Oligo 軟體中使用的是最鄰近法 （the nearest neighbor method）。盡可能使用兩條引物的 Tm 值相同（最好相差不要超過 5℃），退火溫度根據較低的 Tm 值選定，也可以通過改變引物的長度來平衡兩條引物的退火溫度。而對於較長的引物，Tm 值需要考慮動力學參數、從「最近鄰位」的計算方式得到，現有的 PCR 引物設計軟體大多數都採用這種方式。
對於 Tm 值的計算有爭議的地方是附加序列應不應該計算在內，我覺得有值得商討的地方。因為從理論上只有最開始的循環引物的附加序列是不與模板鏈結合的，而在後來的 PCR 反應中，引物的附加序列是和模板鏈結合了的。
ΔG 值是指 DNA 雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性。應當選用 3' 端 ΔG 值較低（絕對值不超過 9），而 5' 端和中間 ΔG 值相對較高的引物。引物的 3' 端的 ΔG 值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發 DNA 聚合反應。
引物二聚體及發夾結構的能值過高（超過 4.5 kcal／mol）易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使 PCR 反應不能正常進行。
引物的 3' 端要與模板嚴格配對，而 5' 端鹼基沒有嚴格的限制，只要與模板 DNA 結合的部分足夠長，其 5' 端鹼基可不與模板 DNA 配對而呈游離狀態，這樣，我們可以在引物的 5' 末端加上酶切位點（引入酶切位點時，要考慮到進行雙酶切的共用緩沖液，否則給下游工作帶來困難）、啟動子，方便下游操作。
引物設計流程
了解了設計原則，接下來我們就看看具體的設計流程，本次講解應用 pubmed 來設計。比如我們要設計小鼠源性白介素 4（IL－4） 的引物。
首先打開 pubmed， 輸入如圖，點擊搜索：
在搜索結果中選擇一個點擊進入，得到如下信息：
點擊上述界面右側的 Pick Primers。
點擊之後進入如下界面，根據上述引物設計原則裡面所述原則，填寫好相關的產物長度，引物長度，Tm 值、FASTA sequence 等信息之後，點擊 get primers。
點擊之後就能得到很多條引物序列啦，根據需要及引物設計原則選擇合適的引物序列即可。
引物設計好後，再應用 BLAST 檢驗一下。步驟如下，打開 pubmed，點擊首頁下方 BLAST。
將剛剛選擇的引物序列輸入，如圖：
點擊 blast，得到：
搜索結果中有我們剛剛查詢的 NM-021283.2，說明此序列無誤。
另外，我們還可以應用 OligoCalc 來檢測引物互補情況，點擊網址 http://biotools.nubic.northwestern.e/OligoCalc.html。進入界面輸入剛剛選擇的引物序列。
點擊 Check 即可，結果顯示 none，則為無互補情況，引物可行。