pcr引物設計網站

1、PCR引物設計時有哪些注意事項

引物抄設計參數：

a
引物長度一般在20bp左右，上下游引物鹼基長度不要相差超過4個鹼基。

b
引物退火溫度一般在58度，不同軟體TM使用不同的演算法，primer3，primer
5，primer
6，primer
express等一般可以設置在55-58度，beacon
design可以設置在65左右。

c
GC含量一般沒什麼特殊要求，40-60最好，如果不好設計，30-80也是可以的。

d
產物長度在100-150,80-200也可以，不要在50bp左右，那樣和引物二聚體不易區分，超過200bp可能會影響PCR擴增效率。

e
軟體給出的引物不能有發卡結構和超過3-4個鹼基的匹配，特別是3`端不能有鹼基匹配，那樣更容易形成二聚體。

f
引物設計好以後，在NCBI上做一個primer-blast，檢測一下是否有非特異性擴增。

2、RT-PCR的引物如何設計？

引物可以通過一些軟體設計，比如primer 5 ，但是還需要注意一些細節問題。
比如
1.引物最好在模板cDNA的保守區內設計。 DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟體（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。
2.引物長度一般在15~30鹼基之間。 引物長度（primer length）常用的是18-27 bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA 聚合酶進行反應。
3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高於Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。

3、pcr引物設計的基本原則有哪些？

引物長度一般為15-30bp，常用的為18-27bp，但不能大於38bp；

引物GC含量一般為40%-60%，以45-55%為宜，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

引物所對應的模板序列的Tm值最好在72℃左右，至少要在55-80℃之間，Tm值曲線以選取72度附近為佳，5'到 3』的下降形狀也有利於引物與模板的結合；

ΔG值（自由能）反應了引物與模板結合的強弱程度，3'端的ΔG值相對要低，且絕對值不要超過9，否則不利於正確引發反應，3'末端雙鏈的ΔG值在0--2kcal/mol時，PCR產量幾乎達到百分之百，但在-6時只達到40%，-8時少於20%，-10時接近於0。

4、pcr引物設計哪些問題

引物的設計一般要考慮以下幾個問題：
1.長度,至少要16bp,通常為18-30bp
2.解鏈溫度（Tm值）
3.避免引物內部或引物之間存在互補序列（3個鹼基）,從而減少引物二聚體的形成以及引物內部二級結構的形成
4.G+C含量盡量控制在40%-60%之間.4鍾鹼基的分布應盡可能均勻.盡量避免嘌呤或嘧啶的連續排列,以及T在3'末端的重復排列
5.引物的3'末端最好是G或C,但不要GC連排

5、怎樣在線做PCR引物設計

百度輸入primer3，應該有2-4個網站可以設計引物，直接把序列放進去就可以了

6、pcr的技術的主要步驟及pcr引物設計的一般原則有哪些

PCR的技術的主要步驟及PCR引物設計的一般原則分述如下：

PCR的技術的主要步驟：

1、DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。

2、退火：（60℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3、延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。

2、引物設計的基本原則

1、引物長度：15-30bp，常用為20bp左右。

2、引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C 過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。

3、引物內部不應出現互補序列。

4、兩個引物之間不應存在互補序列，尤其是避免3 ′端的互補重疊。

5、引物與非特異擴增區的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續8個鹼基在待擴增區以外不能有完全互補序列，否則易導致非特異性擴增。

6、引物3『端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，最佳選擇是G和C。

7、引物的5 ′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質、地高辛標記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

(6)pcr引物設計網站擴展資料

PCR技術的基本原理 類似於DNA的 天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。

PCR是一種體外DNA 擴增技術，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴於DNA聚合酶的酶促合反應，將待擴增的DNA片段與其兩側互補的寡核苷酸鏈引物經「高溫變性——低溫退火——引物延伸」三步反應的多次循環，使DNA片段在數量上呈指數增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。

在環境檢測中，靶核酸序列往往存在於—個復雜的混合物如細胞提取液中，且含量很低，對於探測這種復雜群體中的特異微生物或某個基因，雜交就顯得不敏感。使用PCR技術可將靶序列放大幾個數量級，再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結構。PCR技術常與其他技術結合起來使用， 如RT-PCR、競爭PCR、巢式PCR、RAPf)、ARDRA等。

第一代PCR就是常見的定性PCR技術，它採用普通PCR儀來對靶基因進行擴增，採用瓊脂糖凝膠電泳來對產物進行分析。第二代PCR就是熒光定量PCR技術（Real-Time PCR，qPCR），它通過在反應體系中加入能指示反應進程的熒光試劑來實時監測擴增產物的積累，藉助熒光曲線的Cq值來定量起始靶基因的濃度。

第三代PCR技術--數字PCR（Digital PCR，dPCR，Dig-PCR），是一種全新的對核酸進行檢測和定量的方法。它採用直接計數目標分子而不再依賴任何校準物或外標，即可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目。

PCR晶元技術PCR儀器發展的趨勢之一變得更加微型化，PCR晶元就是在這種趨勢下誕生的。PCR晶元就是在微型的載體上進行PCR反應，是微型化的PCR儀。晶元PCR不僅節省了大量反應試劑因此降低了實驗成本，還有助於提高反應速度。

7、DNA序列的PCR引物設計

1，PCR引物是利用鹼基互補原則，通過找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。
2，首先要找專到你用來設計引物的目的基因全序列，一般NCBI、Genebank上都能找得到。
3，引屬物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應大於38，因為過長會導 致其延伸溫度大於74℃，不適於Taq DNA聚合酶進行反應；引物3』端盡量不要出現3個以上的連續鹼基，如GGG或CCC，這樣會會增加錯配幾率，3』端盡量不要以A為結尾； 引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的 GC含量不能相差太大； ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩 定性。應當選用3』端ΔG值較低（絕對值不超過9），而5』端和中間ΔG值相對較高的引物。引物的3』端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發DNA聚合反應；對引物的修飾一般是在5』端增加酶切位點，應根據下一步實驗中要插入PCR產物 的載體的相應序列而確定。

8、PCR引物設計應遵循哪些原則

PCR引物設計的11條黃金法則 

1.引物最好在模板cDNA的保守區內設計。 DNA序列的保守區是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因，通過序列分析軟體（比如DNAman）比對（Alignment），各基因相同的序列就是該基因的保守區。  

2.引物長度一般在15~30鹼基之間。 引物長度（primerlength）常用的是18-27bp，但不應大於38，因為過長會導致其延伸溫度大於74℃，不適於TaqDNA聚合酶進行反應。

3.引物GC含量在40%~60%之間，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）過高或過低都不利於引發反應。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度，一般高於Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估計引物的Tm值，則有效引物的Tm為55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使復性條件最佳。 

4.引物3′端要避開密碼子的第3位。 如擴增編碼區域，引物3′端不要終止於密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發生簡並，會影響擴增的特異性與效率。

5.引物3′端不能選擇A，最好選擇T。 引物3′端錯配時，不同鹼基引發效率存在著很大的差異，當末位的鹼基為A時，即使在錯配的情況下，也能有引發鏈的合成，而當末位鏈為T時，錯配的引發效率大大降低，G、C錯配的引發效率介於A、T之間，所以3′端最好選擇T。 

6.鹼基要隨機分布。引物序列在模板內應當沒有相似性較高，尤其是3』端相似性較高的列，否則容易導致錯誤引發（Falsepriming）。降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種鹼基的分布最好是隨機的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應超過3個連續的G或C，因這樣會使引物在GC富集序列區錯誤引發。

7.引物自身及引物之間不應存在互補序列。引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發夾結構（Hairpin）使引物本身復性。這種二級結構會因空間位阻而影響引物與模板的復性結合。引物自身不能有連續4個鹼基的互補。兩引物之間也不應具有互補性，尤其應避免3′端的互補重疊以防止引物二聚體（Dimer與Crossdimer）的形成。引物之間不能有連續4個鹼基的互補。引物二聚體及發夾結構如果不可避免的話，應盡量使其△G值不要過高（應小於4.5kcal/mol）。否則易導致產生引物二聚體帶，並且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。

8.引物5′端和中間△G值應該相對較高，而3′端△G值較低。 △G值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，它反映了雙鏈結構內部鹼基對的相對穩定性，△G值越大，則雙鏈越穩定。應當選用5′端和中間△G值相對較高，而3′端△G值較低（絕對值不超過9）的引物。引物3′端的△G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結構並引發DNA聚合反應。（不同位置的△G值可以用Oligo6軟體進行分析）

9.引物的5′端可以修飾，而3′端不可修飾。 引物的5′端決定著PCR產物的長度，它對擴增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質結合DNA序列；引入點突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動子序列等。引物的延伸是從3′端開始的，不能進行任何修飾。3′端也不能有形成任何二級結構可能。 

10.擴增產物的單鏈不能形成二級結構。某些引物無效的主要原因是擴增產物單鏈二級結構的影響，選擇擴增片段時最好避開二級結構區域。用有關軟體（比如RNAstructure）可以預測估計mRNA的穩定二級結構，有助於選擇模板。實驗表明，待擴區域自由能（△G°）小於58.6lkJ/mol時，擴增往往不能成功。若不能避開這一區域時，用7-deaza-2′-脫氧GTP取代dGTP對擴增的成功是有幫助的。  

11.引物應具有特異性。 引物設計完成以後，應對其進行BLAST檢測。如果與其它基因不具有互補性，就可以進行下一步的實驗了。

9、如何進行pcr引物設計？？

NCBI有免費的設計軟體
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

非常好用，權威

把你的序列貼到最上方的空格就可以了，開始的時候，所有的參數都用系統的默認值就可以，不需要修改。