1、運用倒置熒光顯微鏡觀察生物膜需要蓋玻片嗎
xianweijing顯微鏡microscope將微小物體或物體的微細部分高倍放大，以便觀察的儀器或設備。它廣泛應用於工農業生產及科學研究。生物學和醫學工作者在業務中也經常使用顯微鏡。大致分為光學顯微鏡和電子顯微鏡。光學顯微鏡即以可見光為光源的顯微鏡。普通的光學顯微鏡在結構上可分為光學系統和機械裝置兩個部分。光學系統主要包括目鏡、物鏡、聚光器、光闌及光源等部分。機械裝置主要包括鏡筒、鏡柱、載物台、鏡座、粗細調節螺旋等部分（圖1[光學顯微鏡]）。其基本光學原理如圖2[光學顯微鏡成像原理模式圖],圖中左邊小的凸透鏡代表短焦距的一組透鏡，稱物鏡。右邊大的凸透鏡代表長焦距的一組透鏡，稱目鏡。被觀察的物體(AB)放在物鏡焦點(f)稍外的地方。物體的光線通過物鏡後在目鏡焦點(f)稍內方形成一個倒立的放大實像(BA)。觀察者的眼睛通過目鏡將該實像(BA)進一步放大為一個倒立的虛像(BA)。目鏡位於顯微鏡筒的上方，一般由兩個凸透鏡構成。它除了進一步擴大物鏡所形成的實像之外，也限制了眼睛所觀察的視野。按放大率分,常用目鏡有5倍、10倍和15倍三種。物鏡一般位於顯微鏡筒的下方，接近所觀察的物體。由8～10片透鏡組成。其作用一是放大(給物體造成一個放大的實像）,二是保證像的質量,三是提高解析度。常用物鏡可按放大率分為低倍(4×)、中倍(10×或20×)、高倍(40×)和油浸物鏡(100×)。多個物鏡共同鑲在換鏡轉盤上，可以按需要轉動轉盤選擇不同倍數的物鏡。顯微鏡的放大倍數為目鏡倍數乘物鏡倍數，如目鏡為10倍，物鏡為40倍,則放大倍數為40×10倍（放大400倍）。優良的顯微鏡可放大2000倍，可分辨相距1×10cm的兩點。當白光通過凸透鏡時,波長較短的光（藍紫色）,其折射度大於長波長的光（紅橙色），因此，成像時在像周出現各色光譜圍繞,並且有一圈藍色或紅色的輝光,這種顏色上的缺陷稱為色差。由於光線進入（和離開）透鏡鏡面各部分的角度不同，從透鏡四周透過的光線與從透鏡中心透過的光線相比，其折射角度較大。因此，成像時在像周出現模糊而歪曲的影像。這種成像面彎曲的缺陷稱為球面差。一系列形狀、結構和距離不同的凸和凹透鏡組互相配合，便能最大限度地糾正色差和球面差，形成一個明亮、清晰而准確的影像。這就是目鏡或物鏡分別由一組透鏡構成的緣故。這種透鏡稱為平場消色差透鏡。光線從一種介質（如空氣）投射到另一種較為緻密的介質(如玻璃)中時會彎向「法線」（與介質交界面垂直的一條線）,如圖3[光線通過物鏡時的情況]中的BOA線。光線由緻密介質(玻璃)進到不緻密介質(空氣)中時會偏離「法線」，如AOB線(圖3a)當光線穿過聚光鏡玻璃(折射率為1.51)進入空氣時同樣會偏離,向外折射,因此進入物鏡的光量減少很多，像的分辨力也降低。使用100倍物鏡時,如果在物鏡和蓋玻片之間充以油液（折射率同樣為1.51）以隔絕空氣，則光線幾乎可以不折射地進入物鏡，這就增加了像的亮度和解析度。這種物鏡稱為油浸物鏡(圖3b)。聚光器位於顯微鏡台的下方，可會聚來目光源的光線，將光量集中於標本，使標本受到光強適度的均勻照射。聚光器的下端裝有孔徑光闌（光圈）以控制光束的粗細。普通光學顯微鏡的照明光源位於聚光器的下方，為特製的照度均勻的強光燈泡，並且配有可變電阻，可以改變光線的強度。由於普通光學顯微鏡的光源光線自鏡體下方向上透射，通過聚光鏡、物鏡，達到目鏡，因此在醫學及生物學研究中必須將被觀察的樣品切成能透過光線的、厚約6m的薄片，並且要進行染色以顯示不同的組織和細胞等細微結構。整個加工過程稱常規組織製片技術，包括選取適當的組織材料經甲醛（福爾馬林）液固定，逐級酒精脫水，石蠟包埋，用切片機將組織切成薄片裱在玻璃片上，再經蘇木素―伊紅染料著色，最後將組織玻片封固在光學樹脂膠內。制好的組織玻片可長期保存。顯微鏡的目鏡和物鏡安裝在鏡筒的兩端，它們的距離是固定的。將組織玻片放在載物台上，旋轉粗調螺旋使載物台接近物鏡。組織切片進入物鏡第一焦平面，目鏡內即可見標本內的組織影像。然後用細調螺旋使目鏡內的影像清晰即可進行觀察。改換放大倍數時就要調換目鏡或物鏡。醫學和生物學常使用的光學顯微鏡有下列12種：暗視野顯微鏡在普通光學顯微鏡台下配一個暗視野聚光器（圖4）,來自下面光源的光線被拋物面聚光器反射，形成了橫過顯微鏡視野而不進入物鏡的強烈光束。因此視野是暗的，視野中直徑大於0.3m的微粒將光線散射，其大小和形態可清楚看到。甚至可看到普通明視野顯微鏡中看不見的幾個毫微米的微粒。因此在某些細菌、細胞等活體檢查中常常使用。實體顯微鏡由雙筒目鏡和物鏡構成。放大率7～80倍。利用側上方或下方顯微鏡燈照明。在目鏡內形成一個直立的放大實像，可以觀察未經加工的物體的立體形狀、顏色及表面微細結構,並能進行顯微解剖操作,也可以觀察生物機體的組織切片。熒光顯微鏡在短波長光波(紫外光或紫藍色光,波長250～400nm）照射下，某些物質吸收光能，受到激發並釋放出一種能量降級的較長的光波（藍、綠、黃或紅光，波長400～800nm），這種光稱熒光。某種物質在短光波照射下即可發生熒光，如組織內大部分脂質和蛋白質經照射均可發出淡藍色熒光，稱為自發性熒光。但大部分物質需要用熒光染料（如吖啶橙、異硫氰酸熒光素等）染色後，在短光波照射下才能發出熒光。熒光顯微鏡的光源為高壓汞燈，發出的紫外光源經過激發濾光片(此濾光片可通過對標本中熒光物質合宜的激發光)過濾後射向普勒姆氏分色鏡分色鏡將激發光向下反射,通過物鏡投射向經熒光染料染色的標本。染料被激發並釋放出熒光,通過物鏡,穿過分色鏡和目鏡即可進行觀察。目鏡下方安置有屏障濾片(只允許特定波長的熒光通過)以保護眼眼及降低視野暗度(圖4[熒光顯微鏡光學原理])。熒光顯微鏡的特點是靈敏度高，在暗視野中低濃度熒光染色即可顯示出標本內樣品的存在，其對比約為可見光顯微鏡的100倍。30年代熒光染色即已用於細菌、黴菌等微生物及細胞、纖維等的形態觀察和研究。如用抗酸菌熒光染色法可幫助在痰中找到結核桿菌。40年代創造了熒光染料標記蛋白質的技術，這種技術現已廣泛應用於免疫熒光抗體染色的常規技術中，可檢查和定位病毒、細菌、黴菌、原蟲、寄生蟲及動物和人的組織抗原與抗體，可用以探討病因及發病機理，如腎小球疾病的分類及診斷，乳頭瘤病毒與子宮頸癌的關系等。在醫學實驗研究及疾病診斷方面的用途日益廣泛。偏光顯微鏡從光源發出的光線通過空氣和普通玻璃時，在與光線垂直的平面內的各個方向以同一振幅進行振動並迅速向前方傳遞，這是光的波動性原理。空氣與普通玻璃為各向同性體，又稱單折射體。如果該光源的光通過一種各向異性體（又稱雙折射體）時，會將一束光線分為各只有一個振動平面的，而且振動方向互相垂直的兩束光線。這兩束光線的振動方向、速度、折光率和波長都不相同。這樣只有一個振動平面的光線稱偏振光。偏光顯微鏡即利用這一現象而設計。偏光顯微鏡內，在物鏡與目鏡間插入一個檢偏鏡片，光源與聚光器間鑲有起偏鏡片，圓形載物台可以作360°旋轉（圖5[偏光顯微鏡光學原理]）。起偏與檢偏鏡片處於正交檢偏位時，視野完全變黑。將被檢物體放在顯微鏡台上。若被檢物為單折射體，則旋轉鏡台，視野始終黑暗。若旋轉鏡台一周，視野內被檢物四明四暗，則說明被檢物是雙折射體。許多結晶物質（如痛風結節中的尿酸鹽結晶、尿結石、膽結石等），人體組織內的彈力纖維、膠原纖維、染色體和澱粉樣原纖維等都是雙折射體，可借偏振光顯微鏡術檢驗，進行定性和定量分析。位相顯微鏡又稱相差顯微鏡或相襯顯微鏡。普通光學顯微鏡之所以看不見未染色的組織、細胞和細菌、病毒等活機體的圖像，是因為通過樣品的光線變化差別（反差）很小。標本染色後改變了振幅（亮度）和波長（顏色），影響了反差而獲得圖像。但是染色會引起樣品變形，也可使有生命的機體死亡。要觀察不染色的新鮮組織、細胞或其他微小活體必須使用位相顯微鏡。位相顯微鏡的原理是兩個光波因位相差而互相干涉，出現光波強弱和反差的改變而成可見影像。點光源發出的光線可以表現為正弦波圖形(圖6a[位相顯微鏡])。兩個波峰間的距離為波長,波的振幅表示光的亮度(振幅大、亮度高)。設想同一光源發出的兩條光波,分別同時通過空氣及某種透明介質。在通過一定厚度的某種透明介質時，光波的速度就會降低，但是光的亮度未變。光波在通過該透明介質後比一直在空氣中前進的另一條光波遲滯了波長，因而兩條光波出現了位相的變化（位相差）。但人眼不能分辨這兩條平行光線的位相差。如果這兩條光波射到光屏的同一點上，而且一條光波比另一條光波遲滯了半個波長，即兩條光波因位相相反而互相干涉抵消則光線消失，或者相對振幅相互影響而光線減弱。如果一條光波雖然遲滯了一個波長,但兩條光波位相相同,則因波的疊加而光線增強。位相顯微鏡的基本結構與普通光學顯微鏡相同。不同之處在於：①物鏡鏡頭上面，在物鏡第二焦平面裝有一塊圓盤狀的位相板（圖6b[位相顯微鏡]）。②聚光器下面，在聚光器第一焦平面裝有環形光束，光束上刻有狹窄的縫隙可通過環形強光(圖6c[位相顯微鏡])。如圖6d所示，環形光束A點發出的光線經過聚光器後成為平行光線。光線通過載物台上的樣品時，因樣品內各個質點(如b點)的折射率不同而受到干涉，發生衍射,即分為未偏向波（實線）和偏向波(虛線)。未偏向波通過物鏡聚焦於位相板A點上成像，然後通過位相板，均勻地分布在標本像平面上成為背景。偏向波通過物鏡後從位相板A點周圍通過位相板同樣聚焦在像平面的B上。換句話說，未偏向波和偏向波是分別通過位相板的不同部位。在位相板上不同的區域塗有不同的塗層，可以分別改變未偏向波或偏向波的速度和亮度，由此兩種光波出現了位相差，差了半個波長或一個波長，它們在像平面的合波就出現明暗對比，樣品內的各個細節也就能看得見。總之，位相顯微鏡是利用樣品中質點折射率的不同或質點厚度的不等，產生光線的相位差，使新鮮標本不必染色就可以看到，而且能夠觀察到活細胞內線粒體及染色體等精細結構，還可以應用於黴菌、細菌、病毒等更微小活體的研究，進行標本形態、數量、活動及分裂、繁殖等生物學行為觀察，並可進行量度與比較。倒置式顯微鏡普通顯微鏡鏡的物鏡頭方向向下接近標本。倒置式顯微鏡的物鏡鏡頭則處於垂直向上的位置，因此目鏡和鏡筒的縱軸與物鏡的縱軸呈45度角。載物檯面積較大，在物鏡上方，載物台上方有一個長焦距聚光器和照明光源。物鏡和聚光器可裝配位相顯微鏡的附件。放大率16～80倍。組織培養瓶和培養皿可以直接放在載物台上，進行不染色新鮮標本及活體、細胞的形態、數量和動態觀察。可進行多孔微量生物化學及免疫反應平板的結果觀察。倒置式顯微鏡可換用普通亮視野光學鏡頭；可裝配偏振光、微分干涉差、熒光附件進行觀察。微分干涉差顯微鏡(DIC)又稱干擾或干涉顯微鏡。能看到和測定微小的位相變化，與位相顯微鏡相似，使無色透明的標本具有明暗和顏色的變化，從而增強反差。在普通光學顯微鏡的基本結構上安裝偏光和干涉部件，以及360°旋轉載物台它又利用偏振光的干涉原理。如圖7[微分干涉差顯微鏡光學原理]所示,在光源上方安置有起偏鏡片和光束分解棱鏡。從起偏鏡片出來的直線偏振光通過光束分解棱鏡後，分成互相垂直振動的兩條直線偏振光。兩條光線經聚光器折射後射向樣品。因樣品內各個質點的折射射率不同，部分光波的位相改變及因干涉而發生橫向偏移。兩條光線通過物鏡後經第二組光束分解棱鏡相合並，由檢偏鏡發生干涉。終末像的每一個點是由物體上同一點的兩個互相重疊的不同圖像構成的一種混合像，從而使肉眼得以辨識。微分干涉差顯微鏡同樣可以觀察到在普通亮視野中看不見的無色透明物體,可以觀察細胞、細菌等活體,而且影像呈立體感，較位相顯微鏡的影像更細致、更逼真。可用它對活細胞的各個部位作更精細的研究。如果用白光照明，不同位相表現為各種顏色，轉動載物台，顏色會發生變化。單色光照明產生明暗反差，各種成分呈現不同的對比度。微分干涉差顯微鏡又可以作為一種高度精密的超微量光學天平來使用，用以估測的干物體的精確質量可以小到1×克。當細胞中所含固體物質的濃度增加百分之一時，其折射率相應增加0.0018。細胞各相成分的折射率可以根據它與相關區域（懸浮液區）間位種的不同而估計，從而可進一步算出一個細胞中某些成分的乾燥重量。攝影顯微鏡現代高質量顯微鏡均可安裝顯微照相的各種附件，可以及時完整地保留科學資料。用於照相的顯微鏡要求光學系統和機件結構精密，鏡體堅固穩定。它裝配三目鏡筒，其中兩個45°角觀察用目鏡鏡筒和一個中央垂直鏡筒安裝135照相機、曝光測量附件、照相目鏡及取景鏡頭，可以進行取景和調焦。聚光器能調節視場中心並配有孔徑光闌使視場照明均勻。鏡座有可調節視場光闌，有電壓表和電壓顯示燈。有可變電阻調節照明亮度。照明光源為6～12伏40～100瓦鹵素燈泡。80年代的自動曝光顯微照相裝置具有自動卷片，自動測光、自動控制曝光，測量和調整色溫以及倒易律失效的補償等各項功能，均用電子計算機自動控制，可以進行黑白感光片、彩色負片和彩色幻燈片的投照。中央垂直鏡筒又可以安裝電視攝像裝置或16mm電影攝影機及控制裝置，可對活體標本進行定時定格或連續的攝影記錄。萬能研究用攝影顯微鏡系統集普通亮視野、暗視野、偏振光、熒光、位相、微分干涉差、顯微攝影等各項功能於一個系統中。還有電子計算機控制的低倍攝影自動聚焦、自動轉換物鏡、聚光器自動匹配、自動調整光源亮度等功能。機身安裝兩個135照相機,一個4×5英寸大版照相機。可另外安裝電視攝像和16mm電影攝影裝置，同樣具有自動卷片、自動測光、自動控制曝光、測量和調節色溫、倒易體失效補償等多項功能。電子顯微鏡光學顯微鏡的分辨本領由於所用光波的波長而受到限制。小於光波波長的物體因衍射而不能成像。最高級的光學顯微鏡的分辨本領的限度約200nm(2000)。為了突破這一限度，可採用電子射線來代替光波。電子微粒以高速運動時，其行為類似光波的傳播過程。運動電子的波長隨其速度而定，在增壓達50萬伏時，其波長為0.001nm(0.01),即電子射線的波長約為可見光的十萬分之一,其分辨本領的極限約為4，其放大倍數比最高級的光學顯微鏡要高很多級。以電子射線為電子光源的顯微鏡稱為電子顯微鏡。現代醫學和生物學使用的電鏡解析度為5～10,即放大率為10～20萬倍。由於標本厚薄不同，超薄切片機切出的很薄的標本，可用透射式電子顯微鏡觀察。不能切得很薄的標本可用掃描式電鏡進行觀察。透射式電子顯微鏡(TEM)是最常用的電子顯微鏡，由電子槍、電磁透鏡系統、熒光屏（或照相機）、鏡筒、鏡座、變壓器、穩壓裝置、高壓電纜、真空泵系統、操縱台等部分組成電子槍相當於光學顯微鏡中的光源,供應和加速從陰極熱鎢絲發射出來的電子束。電鏡所用的電壓一般在20～30萬伏特，才足以使電子槍里的電子以高速飛出。電子通過聚光透鏡，達到標本上，因為標本很薄，高速電子可以透過，並且由於標本各部分的厚度或密度不同，通過的電子就有疏密之分。電壓需要嚴格穩定才能使成像穩定，很小的電壓改變就會引起嚴重干擾。像的亮度可以通過電子槍來控制。電磁透鏡組相當於光鏡中的聚光器、物鏡及目鏡系統。電子束通過各個電磁透鏡的圓形磁場的中心時可被會聚而產生像。電鏡的透鏡系統由4組電磁透鏡組成,包括聚光透鏡、物鏡、中間透鏡和投射透鏡(目鏡)。可改變聚光透鏡的電流使電子束對標本聚焦並提供「照明」。物鏡靠近標本的焦點上。通過物鏡、中間鏡和投射鏡的三級放大，能在一定的距離處得到高倍的放大像，最終形成的像投射到熒光屏上。在熒光屏部位可換用黑白膠片以製取相片底板。改變電磁線圈中的電流量從而使電磁透鏡調焦，並產生不同的放大率（圖8[透射式電子顯微鏡]）。為了盡量減少電鏡中電子與空氣分子相碰撞而產生散射的機會，鏡筒中的真空度要求很高，因此密封的鏡筒與真空泵相連。由於標本需置於真空的鏡筒內，因此不能檢查活材料。光鏡主要利用可見光波作為光源，樣品染色後改變了光的波長(顏色)和振幅（亮度），影響了反差從而得到圖像。電鏡使用電子射線。電子束的穿透力不強，所以供電鏡檢查的標本必須切到薄至50～100nm厚度的切片。電鏡切片的製作步驟與光鏡切片類似，也是由固定、脫水、包埋、切片和染色等程序組成：首先從欲觀察的標本上取材,體積約1。通過戊二醛和四氧化鋨雙固定後，逐級酒精（或丙酮）脫水,環氧樹脂包埋,超薄切片機切片。在電鏡中像的形成是組織片各個部分對電子束的電子產生不同散射的結果，標本中緻密的地方(細節)散射強。可使用各種重金屬鹽染色以增加反差，常用的是醋酸鈾和枸櫞酸鉛復染。由於電子束穿不透玻璃，染好的薄膜切片放在小銅網格上作電鏡觀察。冷凍蝕刻技術是50年代發明、後來經過改進的一種新的電鏡標本加工技術。其主要原理是把液氮內快速超低溫(-200℃)冷凍的生物標本放在真空冷凍裝置里斷裂，從而將不同部位的細胞器內部結構暴露出來，表現出高低不等的三維結構。在新形成的折斷面上噴鍍一層鉑金碳膜（復型）。將已鍍膜標本在強酸或強鹼性腐蝕溶液里消化，復型膜即漂浮、經打撈、清洗，放在小銅網上進行電鏡觀察和照相。冷凍蝕刻技術在細胞生物膜結構（如細胞膜、線粒體、內質網等）的研究上發揮了重大作用。掃描式電子顯微鏡(SEM)標本較厚的表面要產生一個電子光學圖像就要採用電子掃描法（圖9[掃描電子顯微鏡結構示意圖]）。掃描電鏡的電子槍和電磁透鏡的結構原理類似透射電鏡。電子槍產生的大量電子通過三組電磁透鏡的連續會聚形成一條很細的電子射線（電子探針）。這條電子射線在電鏡筒內兩對偏轉線圈的作用下，順序在標本表面掃描。由於來自鋸齒波發生器的電流同時供應電鏡鏡筒內的和顯示管的兩組偏轉線圈，使得顯示器的電子射線在熒光屏上產生同步掃描。從標本上射出的電子經探測器收集，被視頻放大器放大並控制顯示管亮度。因此在熒光屏上掃描的亮度被標本表面相應點所產生的電子數量所控制，因而在熒光屏上顯示出標本的高倍放大像。通過控制兩套偏轉線圈的電流便可控制放大率的倍數。另外安裝有一個同樣的照相用同步掃描顯示管。掃描電鏡標本製作中，既要脫水又要基本保持其自然狀態，因此使用標本的臨界冷凍乾燥技術：將組織表面清洗干凈，經戊二醛和四氧化鋨雙重固定，逐級丙酮脫水。由於乙酸戊酯與液化Co置換十分容易,因此首先用梯度乙酸戊酯置換丙酮。然後將標本放入密閉耐壓室內，導入液態Co，使之浸沒標本。很快Co將標本內乙酸戊酯完全置換出來，將後者排出耐壓室。同時耐壓室內的液態Co與迅速蒸發的氣態Co分子之間的互變達到動態平衡。使溫度逐漸上升,液態Co蒸發加快而密度相應降低。達到Co的臨界溫度31.1℃時,氣、液二相密度相同，二相的差異完全消失，即達到相的平衡，此時表面張力為零。使溫度繼續保持在稍高於臨界溫度的條件下，緩慢排出Co氣體,當Co排盡時,標本即已乾燥。取出乾燥好的標本，經真空噴鍍一層碳合金，或放入離子鍍膜機內鍍鉑和金，以增加標本的導電能力，加強反差和增強標本的穩定性。然後即可進行掃描電鏡觀察。掃描電鏡具有解析度高、景深長、視野廣、顯示三維立體結構、便於觀察和標本制備簡單等許多優點，在生物學及醫學上應用愈來愈多，用以觀察和研究生物標本的表現形態和內部立體結構。掃描電鏡的分辨本領已達到70的水平，已可以直接觀察脫氧核糖核酸(DNA)的分子結構。
2、利用光學顯微鏡觀察細胞膜時發現其具有暗---亮---暗三層結構
a只有電鏡下才能看到細胞膜的亞顯微結構
b正確
c只有在酸性條件並且水浴加熱下，才能將DNA染成藍色
3、生物膜鏡檢
生物轉盤旋轉時,污水在反應槽中順碟片間隙流動,污水中的有機物被轉盤上的生物膜所吸附.當碟片轉離水面時,盤層表面形成一層污水薄膜,空氣中的氧不斷地溶解到水膜中,生物膜中微生物吸收溶解氧,氧化分解被吸附的有機污染物.碟片每轉為一周,即進行一次吸附—吸氧—氧化分解的程.轉盤不斷轉動,污染物不斷地被氧化分解,生物膜也逐漸變厚,衰老的生物膜在水流剪切力作用下脫落,並隨污水排出沉澱池.轉盤轉動也使槽中污水不斷地攪動充氧,脫落的生物膜在槽中呈懸浮狀態,繼續起凈化作用,因此,生物轉盤兼有活性污泥池的功能.
4、請問生物膜做掃描電鏡該怎麼做固定處理？
掃描電子顯微鏡的設計思想和工作原理，早在1935年便已被提出來了。1942年，英國首先製成一台實驗室用的掃描電鏡，但由於成像的解析度很差，照相時間太長，所以實用價值不大。經過各國科學工作者的努力，尤其是隨著電子工業技術水平的不斷發展，到
1956年開始生產商品掃描電鏡。近數十年來，掃描電鏡已廣泛地應用在生物學、醫學、冶金學等學科的領域中，促進了各有關學科的發展。
一．掃描電鏡的特點
和光學顯微鏡及透射電鏡相比，掃描電鏡具有以下特點：
(一) 能夠直接觀察樣品表面的結構，樣品的尺寸可大至120mm×80mm×50mm。
(二) 樣品制備過程簡單，不用切成薄片。
(三) 樣品可以在樣品室中作三度空間的平移和旋轉，因此，可以從各種角度對樣品進行觀察。
(四) 景深大，圖象富有立體感。掃描電鏡的景深較光學顯微鏡大幾百倍，比透射電鏡大幾十倍。
(五) 圖象的放大范圍廣，解析度也比較高。可放大十幾倍到幾十萬倍，它基本上包括了從放大鏡、光學顯微鏡直到透射電鏡的放大范圍。解析度介於光學顯微鏡與透射電鏡之間，可達3nm。
(六) 電子束對樣品的損傷與污染程度較小。
(七) 在觀察形貌的同時，還可利用從樣品發出的其他信號作微區成分分析。
二．掃描電鏡的結構和工作原理
(一) 結構
1．鏡筒
鏡筒包括電子槍、聚光鏡、物鏡及掃描系統。其作用是產生很細的電子束(直徑約幾個nm)，並且使該電子束在樣品表面掃描，同時激發出各種信號。
2．電子信號的收集與處理系統
在樣品室中，掃描電子束與樣品發生相互作用後產生多種信號，其中包括二次電子、背散射電子、X射線、吸收電子、俄歇(Auger)電子等。在上述信號中，最主要的是二次電子，它是被入射電子所激發出來的樣品原子中的外層電子，產生於樣品表面以下幾nm至
幾十nm的區域，其產生率主要取決於樣品的形貌和成分。通常所說的掃描電鏡像指的就是二次電子像，它是研究樣品表面形貌的最有用的電子信號。檢測二次電子的檢測器(圖15(2)的探頭是一個閃爍體，當電子打到閃爍體上時，1就在其中產生光，這種光被光導管傳送到光電倍增管，光信號即被轉變成電流信號，再經前置放大及視頻放大，電流信號轉變成電壓信號，最後被送到顯像管的柵極。
3．電子信號的顯示與記錄系統
掃描電鏡的圖象顯示在陰極射線管(顯像管)上，並由照相機拍照記錄。顯像管有兩個，一個用來觀察，解析度較低，是長余輝的管子；另一個用來照相記錄，解析度較高，是短余輝的管子。
4．真空系統及電源系統
掃描電鏡的真空系統由機械泵與油擴散泵組成，其作用是使鏡筒內達到 10(4～10(5托的真空度。電源系統供給各部件所需的特定的電源。
(二) 工作原理
從電子槍陰極發出的直徑20(m～30(m的電子束，受到陰陽極之間加速電壓的作用，射向鏡筒，經過聚光鏡及物鏡的會聚作用，縮小成直徑約幾毫微米的電子探針。在物鏡上部的掃描線圈的作用下，電子探針在樣品表面作光柵狀掃描並且激發出多種電子信號。這些電子信號被相應的檢測器檢測，經過放大、轉換，變成電壓信號，最後被送到顯像管的柵極上並且調制顯像管的亮度。顯像管中的電子束在熒光屏上也作光柵狀掃描，並且這種掃描運動與樣品表面的電子束的掃描運動嚴格同步，這樣即獲得襯度與所接收信號強度相對應的掃描電子像，這種圖象反映了樣品表面的形貌特徵。第二節 掃描電鏡生物樣品制備技術大多數生物樣品都含有水分，而且比較柔軟，因此，在進行掃描電鏡觀察前，要對樣品作相應的處理。掃描電鏡樣品制備的主要要求是：盡可能使樣品的表面結構保存好，沒
有變形和污染，樣品乾燥並且有良好導電性能。
一．樣品的初步處理
(一) 取材
取材的基本要求和透射電鏡樣品制備相同，可參考第十四章超薄切片技術中所提的要求。但是，對掃描電鏡來說，樣品可以稍大些，面積可達8mm×8mm，厚度可達5mm。對於易捲曲的樣品如血管、胃腸道粘膜等，可固定在濾紙或卡片紙上，以充分暴露待觀察的組
織表面。
(二) 樣品的清洗
用掃描電鏡觀察的部位常常是樣品的表面，即組織的游離面。由於樣品取自活體組織，其表面常有血液、組織液或粘液附著，這會遮蓋樣品的表面結構，影響觀察。因此，在樣品固定之前，要將這些附著物清洗干凈。清洗的方法有以下幾種：
1．用等滲的生理鹽水或緩沖液清洗；
2．用5%的蘇打水清洗；
3．用超聲震盪或酶消化的方法進行處理。例如清洗腸粘膜表面的粘液，可用下面的方法：
清洗液配方：透明質酸酶 300 (gα—糜蛋白酶 10 mg生理鹽水 100 ml清洗液的pH為5.5～6。清洗的方法是將樣品浸泡在配好的清洗液中，邊浸泡邊震盪30分鍾，最後用雙蒸水洗3次。無論用哪種清洗方法，注意在清洗時不要損傷樣品。
(三) 固定
固定所用的試劑和透射電鏡樣品制備相同，常用戊二醛及鋨酸雙固定。由於樣品體積較大，固定時間應適當延長。也可用快速冷凍固定。
(四) 脫水
樣品經漂洗後用逐級增高濃度的酒精或丙酮脫水，然後進入中間液，一般用醋酸異戊酯作中間液。
二．樣品的乾燥
掃描電鏡觀察樣品要求在高真空中進行。無論是水或脫水溶液，在高真空中都會產生劇烈地汽化，不僅影響真空度、污染樣品，還會破壞樣品的微細結構。因此，樣品在用電鏡觀察之前必須進行乾燥。乾燥的方法有以下幾種：
(一) 空氣乾燥法
空氣乾燥法又稱自然乾燥法，就是將經過脫水的樣品，讓其暴露在空氣中使脫水劑逐漸揮發乾燥。這種方法的最大優點是簡便易行和節省時間；它的主要缺點是在乾燥過程中，組織會由於脫水劑揮發時表面張力的作用而產生收縮變形。因此，該方法一般只適用
於表面較為堅硬的樣品。
(二) 臨界點乾燥法
臨界點乾燥法是利用物質在臨界狀態時，其表面張力等於零的特性，使樣品的液體完全汽化，並以氣體方式排掉，來達到完全乾燥的目的。這樣就可以避免表面張力的影響，較好地保存樣品的微細結構。此法操作較為方便，所用的時間也不算長，一般約2～3小
時即可完成，所以是最為常用的乾燥方法。但用此法，需要特殊儀器設備。
臨界點乾燥是在臨界點乾燥儀中進行的，操作步驟如下：
1．固定、脫水：按常規方法進行。如樣品是用乙醇脫水的，在脫水至100%後，要用純丙酮置換15～20分鍾。
2．轉入中間液：由純丙酮轉入中間液醋酸異戊酯中，時間約15～30分鍾。
3．移至樣品室：將樣品從醋酸異戊酯中取出，放入樣品盒，然後移至臨界點乾燥儀的樣品室內，蓋上蓋並擰緊以防漏氣。
4．用液體二氧化碳置換醋酸異戊酯：在達到臨界狀態(31(C , 72.8大氣壓)後，將溫度再升高10(C，使液體二氧化碳氣化，然後打開放氣閥門，逐漸排出氣體，樣品即完全乾燥。
(三) 冷凍乾燥法
冷凍乾燥法是將經過冷凍的樣品置於高真空中，通過升華除去樣品中的水分或脫水劑的過程。冷凍乾燥的基礎是冰從樣品中升華，即水分從固態直接轉化為氣態，不經過中間的液態，不存在氣相和液相之間的表面張力對樣品的作用，從而減輕在乾燥過程中對樣
品的損傷。冷凍乾燥法有兩種，即含水樣品直接冷凍乾燥和樣品脫水後冷凍乾燥。
1．含水樣品直接冷凍乾燥法
1.1 取材固定：按常規方法進行。
1.2 置於冷凍保護劑中：將樣品置於冷凍保護劑中浸泡數小時。常用的冷凍保護劑為10%～20%二甲基亞碸水溶液，或15%～40%甘油水溶液。
1.3 驟冷：將經過保護劑處理的樣品迅速投入用液氮預冷至(150(C的氟利昂冷凍劑中，使樣品中的水分很快凍結。
1.4 乾燥：將已凍結的樣品移到冷凍乾燥器內已預冷的樣品台上，抽真空，經幾小時或數天後，樣品即達到乾燥。
本方法不需要脫水，避免了有機溶劑對樣品成分的抽提作用，不會使樣品收縮，也是較早使用的方法。但是，由於花費時間長，消耗液氮多，容易產生冰晶損傷，因此未被廣泛應用。
2．樣品脫水後冷凍乾燥
樣品用乙醇或丙酮脫水後過渡到某些易揮發的有機溶劑中，然後連同這些溶劑一起冷凍並在真空中升華而達到乾燥。和前一種方法比較，本方法的優點是不會產生冰晶損傷，
且乾燥時間短。不足之處是有機溶劑對樣品成分有抽提作用，造成部分內含物丟失。乙腈(acetonitrile)真空乾燥法：這是一種利用乙腈在急速蒸發時會冷卻固化的性質將樣品乾燥的方法。其操作步驟如下：
(1). 固定、水洗：按常規方法進行。
(2). 乙腈置換：使用50%?70%?80%?90%的乙腈水溶液置換，最後用100%乙腈代替，每步驟15～20分鍾。
(3). 乾燥：至純乙腈時，放入真空鍍膜台抽真空，乙腈和樣品在真空中很快致冷而被凍結(凍結的溫度為(45(C)，變成冰狀固體。然後繼續抽真空，使凍結的乙腈升華，約需30分鍾，樣品即達乾燥。
樣品乾燥後要粘在樣品台上。對於不鍍膜而直接觀察的樣品，必須用導電膠來粘固；對於要鍍膜的樣品，則可以用膠水或萬能膠來代替，微細的樣品如粉末、纖維等也可用雙面膠紙來粘貼。
三．樣品的導電處理
生物樣品經過脫水、乾燥處理後，其表面不帶電，導電性能也差。用掃描電鏡觀察時，當入射電子束打到樣品上，會在樣品表面產生電荷的積累，形成充電和放電效應，影響對圖象的觀察和拍照記錄。因此在觀察之前要進行導電處理，使樣品表面導電。常用的導電方法有以下幾種：
(一) 金屬鍍膜法
金屬鍍膜法是採用特殊裝置將電阻率小的金屬，如金、鉑、鈀等蒸發後覆蓋在樣品表面的方法。樣品鍍以金屬膜後，不僅可以防止充電、放電效應，還可以減少電子束對樣品的損傷作用，增加二次電子的產生率，獲得良好的圖象。
1．真空鍍膜法
真空鍍膜法是利用真空 膜儀進行的。其原理是在高真空狀態下把所要噴鍍的金屬加熱，當加熱到熔點以上時，會蒸發成極細小的顆粒噴射到樣品上，在樣品表面形成一層金屬膜，使樣品導電。噴鍍用的金屬材料應選擇熔點低、化學性能穩定、在高溫下和鎢不起作用以及有高的二次電子產生率、膜本身沒有結構。現在一般選用金或金和碳。為了獲得細的顆粒，有用鉑或用金—鈀、鉑—鈀合金的。金屬膜的厚度一般為10nm～20nm。真空鍍膜法所形成的膜，金屬顆粒較粗，膜不夠均勻，操作較復雜並且費時，目前已經較少使用。
2．離子濺射鍍膜法
在低真空(0.1～0.01乇)狀態下，在陽極與陰極兩個電極之間加上幾百至上千伏的直流電壓時，電極之間會產生輝光放電。在放電的過程中，氣體分子被電離成帶正電的陽離子和帶負電的電子，並在電場的作用下，陽離子被加速跑向陰極，而電子被加速跑向陽極
。如果陰極用金屬作為電極(常稱靶極)，那麼在陽離子沖擊其表面時，就會將其表面的金屬粒子打出，這種現象稱為濺射。此時被濺射的金屬粒子是中性，即不受電場的作用，而靠重力作用下落。如果將樣品置於下面，被濺射的金屬粒子就會落到樣品表面，形
成一層金屬膜，用這種方法給樣品表面鍍膜，稱為離子濺射鍍膜法，圖15(3顯示該法的原理。
圖15(3 離子濺射鍍膜法原理圖
和真空鍍膜法比較，離子濺射鍍膜法具有以下優點：(1)由於從陰極上飛濺出來的金屬粒子的方向是不一致的，因而金屬粒子能夠進入到樣品表面的縫隙和凹陷處，使樣品表面均勻地鍍上一層金屬膜，對於表面凹凸不平的樣品，也能形成很好的金屬膜，且顆粒較
細。(2)受輻射熱影響較小，對樣品的損傷小。(3)消耗金屬少。(4)所需真空度低，節省時間。
(二) 組織導電法
用金屬鍍膜法使樣品表面導電，需要特殊的設備，操作比較復雜，同時對樣品有一定程度的損傷。為了克服這些不足，有人採用組織導電法(又稱導電染色法)，即利用某些金屬 溶液對生物樣品中的蛋白質?脂類和醣類等成分的結合作用，使樣品表面離子化或產生導電性能好的金屬鹽類化合物，從而提高樣品耐受電子束轟擊的能力和導電率。
此法的基本處理過程是將經過固定、清洗的樣品，用特殊的試劑處理後即可觀察。由於不經過金屬鍍膜，所以不僅能節省時間，而且可以提高解析度，還具有堅韌組織，加強固定效果的作用。
組織導電法主要有碘化鉀導電染色法、碘化鉀--醋酸鉛導電法、丹寧酸—鋨酸導電法等。比較常用的是丹寧酸—鋨酸導電法，其具體操作方法如下：
(1)．樣品處理：按常規方法取材、清洗及用戊二醛固定。
(2)．導電染色：將樣品放入2%～4%丹寧酸溶液中浸泡。如果觀察表面結構，浸泡時間為30分鍾；如果觀察內部結構，浸泡時間為8小時，即可過夜。在浸泡過程中，可更換一次溶液。
(3)．清洗及再固定：用磷酸緩沖液充分清洗，然後放入1%鋨酸中固定2～4小時，再用磷酸緩沖液清洗。
(4)．脫水和乾燥：按常規方法。
(5)．掃描電鏡觀察。
四．幾種特殊的樣品制備技術
(一) 細胞內部結構冷凍割斷法
1972年，日本學者田中敬一採用冷凍樹脂割斷法將細胞打開，用掃描電鏡觀察細胞的內部結構。後來他又以二甲基亞碸代替樹脂進行冷凍割斷取得成功，該方法簡便，結構清晰，已得到廣泛應用。其操作方法如下：
1．取材和固定：為了使細胞結構清晰，不被過多的血細胞污染，可在取材前用灌注法沖洗。即先將動物麻醉，經腹主動脈注入生理鹽水或低分子量的右,切開下腔靜脈放血，至無血色為止。然後迅速取材，將樣品修成1mm×1mm×5mm大小，投入1%鋨酸溶液中固定1小時，用1/15M磷酸緩沖液 (pH7.4)清洗兩次，每次10分鍾。
2．二甲基亞 浸泡：將樣品依次放入25%、50%二甲基亞碸溶液中，各浸泡30分鍾。
3．割斷：用TF—1型冷凍割斷裝置進行割斷。然後將割斷後的樣品放到50%二甲基亞碸中，等融化後再用1/15M磷酸緩沖液浸洗，每次10分鍾，換液5次。
4．軟化及後固定：將樣品放入0.1%鋨酸中軟化，溫度20(C，時間48～72小時。然後用1% 八 固定1小時，雙蒸水浸洗1小時，換液幾次，需徹底清洗干凈。
5．導電染色：將樣品放入2%丹寧酸中2小時(或過夜)，以雙蒸水清洗1小時，換液幾次。再以1% 八 固定30～60分鍾，雙蒸水清洗1小時。
6．脫水、乾燥及鍍膜：按常規方法進行。
(二) 鑄型技術
為了研究空腔臟器特別是血管系統復雜的立體分布，先向腔內注射某種成形物質，待該物硬化後再把組織腐蝕去掉，剩下的成形物即能顯示血管系統的立體分布，這種技術稱鑄型技術。如果是研究血管系統，稱為血管鑄型。用鑄型技術製作的標本，經過鍍膜後，就可進行掃描電鏡觀察。
常用的鑄型劑有甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯及其共聚物以及ABS等。ABS是一種樹脂，為丙烯晴、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物，被認為是比較理想的鑄型劑。下面簡單介紹用ABS製作血管鑄型標本的方法：
1．灌流和注入鑄型劑
首先將准備灌注的器官取下或保持自然位置，找到動脈，插入玻璃管或靜脈穿刺針，並以粗絲線結扎之，用普通流水或溫鹽水將血管中的血液沖洗干凈。然後灌注鑄型劑ABS丁酮溶液，濃度為5%～30%，注入的壓力為100mmHg。注入鑄型劑的臟器，可以放在50(C～60(C 的溫水中浸泡6小時左右，這樣既能保持臟器的原形，也有助於鑄型劑的硬化。
2．腐蝕和清洗
將標本放入10%～20%氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液中腐蝕，也有放20%～30%鹽酸中腐蝕。時間一般為5～7天。若用稀鹽酸腐蝕，可加入5%～10%胃蛋白酶，腐蝕的效果更好。然後用流水將血管鑄型周圍被腐蝕的組織沖洗干凈，時間為24～72小時，沖洗的速度要慢。
3．顯微解剖和剝制鑄型
為了暴露和切取要觀察的部分，需要在解剖顯微鏡下進行。如果鑄型太硬，可將鑄型浸入酒精中，加溫至40～60(C，能使鑄型變軟，便於解剖和切取。
4．乾燥和鍍膜
將切取的鑄型用蒸餾水洗干凈，用濾紙吸干後放37(C溫箱中30～60分鍾，最後放乾燥缸中保存。鍍膜可用真空噴鍍，也可用離子鍍膜，方法同前。鍍膜後就可用掃描電鏡觀察
。
(三) 鹽酸化學消化法
為了研究被觀察細胞的基底面及深層細胞表面，可採用鹽酸化學消化法制備樣品。
1．固定和清洗：同常規方法。
2．鹽酸消化：用8mol/L鹽酸消化和腐蝕，其溫度與時間根據不同組織而異。
3．清潔樣品：用2%～5%Tween20作用3小時，以清潔樣品和穩定其結構。
4．脫水、乾燥和鍍膜：按常規方法處理。
5、使用什麼顯微鏡可以觀察細菌的生物膜
細胞膜用光學顯微鏡就可以，但要觀察有些細胞器乃至細胞器膜就得用電子顯微鏡。生物膜是細胞膜+細胞器膜
6、電鏡下觀察的生物膜結構可見 選項: a、兩層深色緻密層和中間一層淺色疏鬆層 b、兩層深色疏鬆層和中間一層
a。兩層緻密的是磷脂分子層，因為是兩層磷脂分子，所以兩層緻密的；中間餓淺色疏鬆層是兩層磷脂分子之間的物質。
7、在電子顯微鏡下觀察細胞膜，可以看到的是兩條暗帶中間夾一條明帶，那麼對這兩條暗帶和一條明帶的化學成分
答案是：D 。
1959年羅伯特森看到的暗—亮—暗的現象，其實是兩層磷脂分子層（暗）和中間的一層，而中間的一導中主要是蛋白質，兩條暗帶的成分雖然主要是磷脂，但是還是有蛋白質。
8、激光共聚焦顯微鏡怎麼觀察生物膜
熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡的區別
激光共聚焦顯微鏡是採用激光作為光源，在傳統光學顯微鏡基礎上採用共軛聚焦原理和裝置，並利用計算機對所觀察的對象進行數字圖象處理的一套觀察、分析和輸出系統。主要系統包括激光光源、自動顯微鏡、掃描模塊（包括共聚焦光路通道和針孔、掃描鏡、檢測器）、數字信號處理器、計算機以及圖象輸出設備（顯示器、彩色列印機）等。通過激光掃描共聚焦顯微鏡，可以對觀察樣品進行斷層掃描和成像。因此，可以無損傷的觀察和分析細胞的三維空間結構。
同時，通過激光掃描共聚焦顯微鏡也是活細胞的動態觀察、多重免疫熒游標記和離子熒游標記觀察的有力工具.精確地對光譜的本質進行分析，區分發射光譜高度重疊的不同標記的信號。
最重要的是，對於多色的熒光染色，它能徹底消除了熒光串色的影響，同時最大限度的減少了樣品熒光信號的損失。這些都是一般光鏡所不能達到的。
9、我想問問如何判斷生物膜掛膜成功？？
1.調試成功通過直接觀察生物膜形成狀態可以判斷。2.微生物觀察是一個輔佐的參考。3.顯微鏡觀察，生物膜應該以放線狀的菌絲體及活性泥團為底膜。並夾有多量原生動物及後生動物，提示生物膜已進入正常微生物環境的代謝狀態。4.培養初期的生物膜會夾有多量細小的非活性污泥類原生動物，罕見後生動物。非活性污泥類原生動物以滴蟲、側跳蟲、小輪甲蟲為主。5.正常階段生物，以匍匐類原生動物及附著類原生動物為主，並可見多量後生動物。
10、用什麼樣的顯微鏡可以看到細胞膜
細胞膜屬於細胞內的生物膜，也是細胞的基本結構，如果只是要看到細胞膜，用普通的光學顯微鏡就能看到；如果要想看到細胞膜的精細結構，就必須使用電子顯微鏡才能觀察到。