冷凍掃描電鏡cyroSEM

1、漲知識丨冷凍電鏡是什麼？為什麼能夠斬獲今年諾貝爾化學獎

冷凍電鏡，是用於掃描電鏡的超低溫冷凍制樣及傳輸技術(Cryo-SEM)，可實現直接觀察液體、半液體及對電子束敏感的樣品，如生物、高分子材料等。
冷凍電鏡技術為何摘得2017年的諾貝爾化學獎
撰文 | 何萬中（北京生命科學研究所研究員）
2013年，冷凍電鏡技術的突破給結構生物學領域帶來了一場完美的風暴，迅速席捲了結構生物學領域，傳統X射線、傳統晶體學長期無法解決的許多重要大型復合體及膜蛋白的原子解析度結構，一個個被迅速解決，紛紛強勢佔領頂級期刊和各大媒體版面，比如程亦凡博士、施一公博士、楊茂君博士、柳正峰博士所解析的原子解析度重要復合體結構，震驚世界。
這場冷凍電鏡革命的特點是：不需要結晶且需要樣品量極少，即可迅速解析大型蛋白復合體原子解析度三維結構。這場電子顯微學解析度革命的突破有兩個關鍵技術：直接電子相機（其中演算法方面程亦凡博士和李雪明博士有重要貢獻）和三維重構軟體。
引領這些技術突破的背後離不開三位冷凍電鏡領域的開拓者：理查德·亨德森（Richard Henderson）、約阿希姆·弗蘭克（Joachim Frank）和 Jacques Dubochet分別在基本理論、重構演算法和實驗方面的早期重要貢獻。
我本人與這三位科學家都有曾過面對面的交流，也是讀他們的文章進入這個領域的，下面簡要談談他們的貢獻。
電子顯微鏡於1931年發明，但在生物學領域的應用滯後於材料科學，原因在於生物樣品含水分才會穩定，而電子顯微鏡必須在高真空下才能工作，因此如何製作高解析度生物電鏡樣品是個技術瓶頸。傳統的重金屬負染技術，可以讓重金屬包被蛋白表面，然後脫水乾燥製作適合真空成像的樣品，但這會導致樣品解析度降低（至多保存1.5納米）。
1968年，英國劍橋大學MRC實驗室的Klug博士和他的學生DeRosier開創了基於負染的噬菌體病毒的電鏡三維重構技術（Klug 博士獲1982年諾貝爾化學獎）。但如何保持生物樣品原子解析度結構又適合電鏡成像呢？加州大學伯克利分校的Robert Glaeser博士和他學生Ken Taylor 於1974年首次提出並測試了冷凍含水生物樣品的電鏡成像，可以有效降低輻照損傷對高解析度結構破壞和維持高真空，實現高解析度成像的新思路，這就是冷凍電鏡（CryoEM）的雛形。

1982年，Dubochet 博士領導的小組開發出真正成熟可用的快速投入冷凍制樣技術製作不形成冰晶體的玻璃態冰包埋樣品，隨著冷台技術的開發，冷凍電鏡技術正式推廣開來。
在Klug博士提出的三維重構技術基礎上，MRC實驗室的Richard Henderson博士（物理學及X射線晶體學背景）跟同事Unwin 博士1975年開創了二維電子晶體學三維重構技術，隨後應用該技術技術解析了第一個膜蛋白細菌視覺紫紅質蛋白的三維結構，1990達到3.5埃，這是一個非常了不起的工作，但是第一個類似的膜蛋白結構的諾貝爾獎還是被X射線晶體學家米歇爾於1988年奪走了。二維晶體最大問題在於很難長出二維晶體，因而應用范圍很窄，且容易被X射線晶體學家搶了飯碗（本人剛入行第一個薄三維晶體項目就被搶了）。
上世紀90年代，Henderson博士轉向了剛興起的另一項CryoEM三維重構技術，即Joachim Frank 博士發展的單顆粒分析重構技術，無需結晶就可以對一系列蛋白或復合體顆粒直接成像，對位平均分類，然後三維重構。Henderson 博士憑借他深厚的物理學及電子顯微學功底，以及非凡的洞察力，提出實現原子解析度CryoEM技術的可行性，在理論上做了一系列超前的預見，比如電子束引起的樣品漂移必須解決才能實現原子解析度，為後期直接電子相機的突破指明了方向，他本人也投身於直接電子相機的開發。
因此，在這場電鏡解析度的革命中，Henderson博士是個不折不扣的發起者。另外，三維重構新演算法的突破也有Henderson 博士的獨具慧眼有關，Sjors Scheres博士在沒有很強論文情況下被他看中招募到MRC後因為開發經典的Relion 三維重構演算法大放異彩。
最後，我們再介紹一下發展冷凍電鏡單顆粒三維重構技術的Joachim Frank博士，他也是物理學背景。Frank 博士是單顆粒分析鼻祖，單顆粒三維重構演算法及軟體Spider的作者。
Frank 師從德國著名的電子顯微學家Hoppe博士，Hoppe學派主張對任意形狀樣品直接三維重構，後來的電子斷層三維重構及cryoEM三維重構技術都與他的早期思想有關。Frank博士提出基於各個分散的全同顆粒（蛋白）的二維投影照片，經過分類對位平均，然後三維重構獲得蛋白的三維結構，發展了一系列演算法並編寫軟體（SPIDER）實現無需結晶的蛋白質三維結構解析技術。尤其在核糖體三維重構方面有一系列的重要開創性工作，可惜當年核糖體結構諾貝爾獎沒有給他。現在給他在cryoEM單顆粒三維重構的一個諾貝爾獎，實至名歸。

2、冷凍電鏡是什麼？為什麼能夠斬獲今年諾貝爾化學獎

在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術，就叫做冷凍電子顯微鏡技術，簡稱冷凍電鏡（cryo-electron microscopy， cryo-EM）。
冷凍電鏡是重要的結構生物學研究方法，它與另外兩種技術：X射線晶體學（X-ray crystallography）和核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）一起構成了高解析度結構生物學研究的基礎，在獲得生物大分子的結構並揭示其功能方面極為重要。
冷凍電鏡並不是這兩年才建立的。在蛋白質X射線晶體學誕生大約10多年以後的1968年， 作為里程碑式的電鏡三維重構方法，同樣在劍橋MRC分子生物學實驗室誕生，Aron Klug教授因此獲得了1982年的諾貝爾化學獎。另一些突破性的技術在上世紀70年代和80年代中葉誕生，主要是冷凍成像和蛋白快速冷凍技術。
快速冷凍可以使蛋白質和所在的水溶液環境迅速從溶液態轉變為玻璃態，玻璃態能使蛋白質結構保持其天然結構狀態，如果以緩慢溫和的方式冷凍，這個過程會形成晶體冰，生物分子的結構將被晶格力徹底損壞。

低劑量冷凍成像能夠保存樣品的高解析度結構信息，確保了從電鏡圖形中解析蛋白質結構的可能性。與此同時，2017諾貝爾化學獎得主Joachim Frank等，則在電鏡圖像處理演算法方面奠定和發展了這項技術的理論基礎。由此冷凍電鏡的雛形基本建立，總的思路為：樣品冷凍（保持蛋白溶液態結構）——冷凍成像（獲取二維投影圖像）——三維重構（從二維圖像通過計算得到三維密度圖）。

根據諾貝爾獎評委會的說法，這項技術使生物分子成像變得更加簡單，將生物化學帶入了一個新紀元。

3、冷熱場發射掃描電鏡的區別是什麼?

場發射分熱場和冷場，共性是解析度高。熱場的束流大些，適合進行分析，但維護成本相對較高，維護要求高。冷場做表面形貌觀測是適合的，相對而言維護成本低些，維護要求不算高。

冷場發射電子槍
優點：單色性好，解析度高
缺點：電子槍束流不穩定，束流小，不適合做能譜分析，每天要做一次Flash
熱場發射電子槍
優點：電子束穩定，束流大
缺點：與冷場相比除了單色性和解析度略差點外，其它找不出缺點。

熱場在總發射電流（Total emission current）、最大探針電流（Maximum probe current）、電子束雜訊（Beam noise）、發射電流漂移（Emission current drift）、工作真空（Operating vacuum）、陰極還原（Cathode regeneration）、對外部影響的敏感性（Sensitivity to external influence）等方面都具有一等的優勢。這些參數直接影響電鏡的性能。在陰極半徑（Cathode radius）、有效電子源半徑（Effective source radius）、發射電流密度（Emission current density）、標准亮度（Normalised brightness）等方面，冷場發射略勝一籌。這幾個參數總起來說就是冷場發射陰極的發射面積較小、能量集中，便於將電子束聚焦於一個很小的點，以提高解析度。但是在現代的電鏡技術條件下，熱場發射電鏡通過採取各種有效措施，也能夠將電子束匯聚於一個理想的點，達到冷場發射電鏡的解析度水平。
熱場發射電鏡主要的一個缺點是燈絲（陰極）壽命較短，給定壽命2000小時，實際可用3年左右。而冷場發射陰極壽命相對較長，且更換費用較低。

4、掃描電鏡的工作原理是什麼

掃描電鏡從原理上講就是利用聚焦得非常細的高能電子束在試樣上掃描，激發出各種物理信息。通過對這些信息的接受、放大和顯示成像，獲得測試試樣表面形貌的觀察。

當一束極細的高能入射電子轟擊掃描樣品表面時，被激發的區域將產生二次電子、俄歇電子、特徵x射線和連續譜X射線、背散射電子、透射電子，以及在可見、紫外、紅外光區域產生的電磁輻射。同時可產生電子-空穴對、晶格振動（聲子)、電子振盪（等離子體）。

(4)冷凍掃描電鏡cyroSEM擴展資料：

研發歷程：

1873 Abbe 和Helmholfz 分別提出解像力與照射光的波長成反比。奠定了顯微鏡的理論基礎。

1931德國物理學家Knoll 及Ruska 首先發展出穿透式電子顯微鏡原型機。

1938 第一部掃描電子顯微鏡由Von Ardenne 發展成功。

1959年第一台100KV電子顯微鏡 1975年第一台掃描電子顯微鏡DX3 在中國科學院科學儀器廠（現北京中科科儀技術發展有限責任公司）研發成功。

5、掃描電鏡（SEM）測試是怎麼收費的

掃描電鏡（SEM）測試各地不一樣的，最少的也要幾百塊啊

6、生物電鏡冷凍制樣：做了才知道有多難

掃描電鏡只能對樣品表面進行成像，即使是液相，也只能是液體表面，這個在環境掃描電鏡中已經成功試驗過，觀察水蒸氣在玻璃板上的凝聚和蒸發過程，液滴的表面形貌清晰可見。無論傳統掃描電鏡還是環境真空掃描電鏡都必須把懸濁液中物質表面從液體中暴露出來，否則都無法觀察到懸濁物的形態。由於制樣原因，可能造成乳液中的懸浮物凝聚或者變形，所以你沒法用提取的懸濁物的法來實現SEM觀察。解決方案只有掃描電鏡配冷凍台來進行觀察，一般液體快速冷凍然後割斷觀察斷口，會看到您想看的相。顯微鏡通過載玻片制樣後，乳液中的疏水物質在液體中清晰可見，使用的穿透光，而不是反射光。

7、做掃描電鏡的樣品可不可以冷凍乾燥

這個問題要分情況討論。
首先，對於傳統電鏡來說，放入的樣品必須是乾燥的，冷熱與否沒有具體要求，當然也不能過熱或過冷，樣品都沒法裝入。
另外，對於樣品來說，如果冷凍乾燥，不會對樣品造成影響，就可以進行冷凍乾燥

8、掃描電鏡sem的主要原理是什麼？測試過程需要重點注意哪些操作

電鏡的原理是：電子槍發出電子束打到樣品表面，激發出二次電子、背散射電子、X-ray等特徵信號，經收集轉化為數字信號，得到相應的形貌或成分信息。
測試注意事項：
1、新人找別人幫忙測試時，
明確自己的測試內容，如何樣品前處理，測試時間，然後跟測試相關人員聯系確定能否滿足你的測試需求
2、新人自己操作測試時，
明確自己的測試內容，如何樣品前處理，測試時間，
測試時注意樣品乾燥潔凈，操作時樣品和樣品台避免撞到探頭

9、為什麼冷凍電鏡 Cryo

冷凍電鏡，是用於掃描電鏡的超低溫冷凍制樣及傳輸技術(Cryo-SEM)，可實現直接觀察液體、半液體及對電子束敏感的樣品，如生物、高分子材料等。樣品經過超低溫冷凍、斷裂、鍍膜制樣（噴金/噴碳）等處理後，通過冷凍傳輸系統放入電鏡內的冷台（溫度可至-185℃）即可進行觀察。其中，快速冷凍技術可使水在低溫狀態下呈玻璃態，減少冰晶的產生，從而不影響樣品本身結構，冷凍傳輸系統保證在低溫狀態下對樣品進行電鏡觀察。[1]